GB 4789.41-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验.pdf

书 书 书中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准犌犅 食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验 发布 实施中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发 布书 书 书犌犅 食品安全国家标准食品微生物学检验肠杆菌科检验范围本标准规定了食品中肠杆菌科（ ）的检验方法。本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数；第二法适用于肠杆菌科含量较低食品中肠杆菌科的计数。术语和定义 肠杆菌科犈狀 狋 犲 狉 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 犪 犮 犲 犪 犲在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 肠杆菌科计数犈狀 狌犿犲 狉 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犈狀 狋 犲 狉 狅 犫 犪 犮 狋 犲 狉 犻 犪 犮 犲 犪 犲按本标准规定方法，对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。 最可能数犿狅 狊 狋狆 狉 狅 犫 犪 犫 犾 犲狀 狌犿犫 犲 狉；犕犘犖基于泊松分布的一种间接计数方法。设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 恒温培养箱： 。 冰箱：。 水浴箱： 。 天平：感量 。 显微镜： 倍 倍。 均质器。 振荡器。 无菌吸管：（具 刻度） 、 （具 刻度）或微量移液器及吸头。 无菌锥形瓶或等效容器：容量 、 。 无菌培养皿：直径 。 无菌试管： 、 。 计或比色管或精密试纸。培养基和试剂 缓冲蛋白胨水（） ：见 。犌犅 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤（肉汤） ：见 。 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（） ：见 。 营养琼脂（） ：见 。 葡萄糖琼脂：见 。 革兰氏染色液：见 。 氧化酶试剂：见 。 无菌 ：见 。 无菌 ：见 。第一法肠杆菌科平板计数法检验程序肠杆菌科平板计数法检验程序见图。图肠杆菌科平板计数法检验程序犌犅 操作步骤 样品的稀释 固体和半固体样品：称取 样品放入盛有 的无菌均质杯中， 均质 ，或放入盛有 的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打 ，制成 的样品匀液。 液体样品：以无菌吸管吸取 样品放入盛有 的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成 的样品匀液。 用无菌吸管或微量移液器吸取 样品匀液，沿管壁缓缓注入盛有的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面） ，振摇试管或换用支无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成 的样品匀液。 按 操作程序，依次制成 倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释次，换用支无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过 。 倾注平板和培养 根据对样品污染状况的估计及相关限量要求，选择个个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液） ，每个稀释度接种个无菌平皿。同时，分别吸取加入两个无菌平皿内作为空白对照。 将 冷却至 的（可放置于 恒温水浴箱中保温）倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，使样品匀液与培养基充分混匀。 待琼脂凝固后，倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层。防止蔓延生长并使菌落特征更为明显。 待平板上层琼脂凝固后翻转平板， 培养 。 典型菌落计数和确认 肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在 之间、无蔓延菌落生长的平板，只计数典型菌落数。菌落计数以菌落形成单位（ ，）表示。 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以，代表一个平板菌落数。 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。 从每个平板上至少挑取个（小于个全选）典型菌落进行确认；如果有不同形态的典型菌落，则每种形态分别至少挑取个菌落进行确认。 典型菌落的确认：）分别将所挑选的每一个菌落，划线于营养琼脂平板， 培养 ，挑取平板上的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。）革兰氏染色镜检：肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌，无芽孢，大小为（ ）（ ）。）氧化酶试验：用铂铱接种环或玻璃棒（不要用镍铬接种环）挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂犌犅 的滤纸上，滤纸的颜色在 内变成蓝紫色，判为阳性反应。）葡萄糖发酵试验：用接种针挑取少许氧化酶阴性的同一个菌落，穿刺于葡萄糖琼脂内，于 培养 ，若试管内的内容物变为黄色，判为阳性反应。 结果的计算 一般原则若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内，按式（）计算，示例见 、 、 、 。犖犪（狀 狀）犱（）式中：犖 样品中肠杆菌科菌落数；犪 确证的肠杆菌科菌落数之和；狀 第一稀释度（低稀释倍数）平板个数（含确证的肠杆菌科菌落） ；狀 第二稀释度（高稀释倍数）平板个数（含确证的肠杆菌科菌落） ；犱 稀释因子（第一稀释度） 。其中，犪按式（）计算：犪犫犃犆（）式中：犪 确证的肠杆菌科菌落数；犫 某一平板中犃个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数，犫犃；犃 某一平板中用于确认试验的菌落数；犆 某一平板中典型菌落总数。 低菌落数若最低稀释度（包括液体样品原液）平板的典型菌落数均小于 ，具有确证的肠杆菌科菌落，则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。若最低稀释度（包括液体样品原液）平板均无菌落生长，或典型菌落数均小于 ，且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于乘以最低稀释倍数计算。 特殊情况第一稀释度平板上的典型菌落数均大于 ，且有确证的肠杆菌科菌落，以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在 之间，则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算，示例见 。若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内，且无确证的肠杆菌科菌落，则以小于乘以最低稀释倍数计算。报告 菌落数小于 时，以整数报告。 菌落数大于或等于 时，对第位数字进行修约后，取前位数字，后面用代替位数；也可用 的指数形式来表示，采用两位有效数字。 数字修约按“四舍五入”原则进行。犌犅 若所有平板上为蔓延菌落而无法计数，则报告菌落蔓延。 若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。 称重取样以为单位报告，体积取样以为单位报告。第二法肠杆菌科犕犘犖计数法检验程序肠杆菌科计数法检验程序见图。图肠杆菌科犕犘犖计数法检验程序犌犅 操作步骤 样品的稀释按 进行。 接种和培养 非选择性前增菌根据对样品污染状况的估计及相关限量要求，选择个适宜连续稀释度的样品匀液，每个稀释度管，共管于 培养 。 选择性增菌从各培养管中，分别移取培养物，接种于 的肉汤中， 培养 。 分离用接种环从各肉汤管中分别取培养物环，划线接种于平板， 培养 ，观察平板上有无典型菌落。 典型菌落的确认典型菌落确认见 。 报告肠杆菌科为革兰氏阴性无芽胞杆菌，发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性。只要有个菌落确认为肠杆菌科，其所代表的管即为肠杆菌科阳性，依据阳性管数查表（见附录） ，报告每克（毫升）样品中肠杆菌科的值。称重取样以为单位报告，体积取样以为单位报告。犌犅 附录犃结果计算示例犃 两个连续稀释度均含适宜的典型菌落数平板，并含有已确证的肠杆菌科菌落，数据见表 。表犃 肠杆菌科平板计数结果示例稀释度 （第一稀释度） （第二稀释度）典型菌落数 用于确认试验的菌落数确证的菌落数犪 犖 （ ） 上述数据按 数字修约后，表示为 或 。犃 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，其中某一稀释度的一个平板菌落数不在适宜范围内，或者两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内，则相应的平板不作为计数平板，数据见表 。表犃 肠杆菌科平板计数结果示例稀释度 （第一稀释度） （第二稀释度）典型菌落数 用于确认试验的菌落数确证的菌落数犪 犖 （ ） 上述数据按 数字修约后，表示为 或 。犃 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，其中一个平板无已确证的肠杆菌科菌落，则相应的平板不作为计数平板，数据见表 。表犃 肠杆菌科平板计数结果示例稀释度 （第一稀释度） （第二稀释度）典型菌落数 用于确认试验的菌落数确证的菌落数犪 犖 （ ） 上述数据按 数字修约后，表示为 或 。犌犅 犃 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板，但无已确证的肠杆菌科菌落，则以小于乘以最低稀释倍数计算。犃 第一稀释度平板上的菌落数超过 ，且有证实的肠杆菌科菌落，以及第二稀释度平板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在 之间，则以确证的菌落数乘以第一稀释倍数计算，数据见表 。表犃 肠杆菌科平板计数结果示例稀释度 （第一稀释度） （第二稀释度）典型菌落数 用于确认试验的菌落数确证的菌落数犪 犖 （） 犌犅 附录犅培养基和试剂犅 缓冲蛋白胨水（犅犘犠）犅 成分蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 蒸馏水 犅 制法将 成分加热溶解，于 时调节至 ，分装于 广口瓶中，每瓶 ， 高压灭菌 。犅 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤（犈犈肉汤）犅 成分蛋白胨 葡萄糖 磷酸氢二钠（无水） 磷酸二氢钾 牛胆盐 煌绿 蒸馏水 犅 制法将 成分溶于水中，加热煮沸至完全溶解，加热不宜超过 ，迅速冷却培养基，于 调节至 ，分装于灭菌的 试管中，每管 ，不需高压灭菌，可存放一个月。犅 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂（犞犚犅犌犃）犅 成分蛋白胨 酵母浸膏 号胆盐 葡萄糖 氯化钠 犌犅 中性红 （或 酒精溶液）结晶紫 （或 水溶液）琼脂粉 蒸馏水 犅 制法将 成分溶于水中，加热煮沸至完全溶解， 时调节至 ，分装于灭菌的锥形烧瓶中，不需高压灭菌，用前制备。倾注平板，使用前干燥平板。未干燥的平板可存放两周。犅 营养琼脂（犖犃）犅 成分牛肉浸膏 蛋白胨 琼脂粉 蒸馏水 犅 制法将 成分溶于水中，加热煮沸， 时调节至 ， 高压灭菌 。倾注平板，使用前干燥平板。未干燥的平板于可存放两周。犅 葡萄糖琼脂犅 成分胰蛋白胨 酵母浸膏 葡萄糖 氯化钠 溴甲酚紫 （或 溴甲酚紫酒精溶液 ）琼脂粉 蒸馏水 犅 制法将 成分溶于水中，加热煮沸， 时调节至 ，分装于 试管，每管约， 高压灭菌 后，试管垂直放置。于可存放周。为去除培养基中的氧气，使用前可将葡萄糖琼脂试管置于沸水浴中 ，然后迅速冷却，备用。犅 革兰氏染色液犅 结晶紫染色液犅 成分结晶紫 犌犅 乙醇 草酸铵水溶液 犅 制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。犅 革兰氏碘液犅 成分碘 碘化钾 蒸馏水 犅 制法将碘和碘化钾先行混合，加入少许蒸馏水充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至 。犅 沙黄复染液犅 成分沙黄 乙醇 蒸馏水 犅 制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。犅 染色方法犅 将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染 ，水洗。犅 滴加革兰氏碘液，作用 ，水洗。犅 滴加 乙醇脱色 ，直至染色液被洗掉，但不要过分脱色、水洗。犅 加沙黄复染液，复染 ，水洗、干燥、镜检。犅 革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。犅 氧化酶试剂犅 成分犖，犖，犖，犖四甲基对苯二胺盐酸盐 蒸馏水 犅 制法将 成分溶解于冷水中，少量新鲜配制。犅 试验方法用细玻璃棒或一次性接种针挑去单个菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸上。在 内呈现粉红犌犅 或紫红色，即为氧化酶试验阳性。不变色者为氧化酶试验阴性。犅 无菌犿狅 犾犔犖犪犗犎犅 成分 蒸馏水 犅 制法称取 氢氧化钠溶于 蒸馏水中， 高压灭菌 。犅 无菌犿狅 犾犔犎犆 犾犅 成分 蒸馏水 犅 制法移取浓盐酸 ，用蒸馏水稀释至 ， 高压灭菌 。犌犅 附录犆肠杆菌科最可能数（犕犘犖）检索表每克（毫升）检样中肠杆菌科最可能数（）的检索见表 。表犆 肠杆菌科最可能数（犕犘犖）的检索表阳性管数 置信区间下限上限阳性管数 置信区间下限上限 注：本表采用个稀释度 （） 、 （）和 （） ，每个稀释度接种管。注：表内所列检样量如改用（） 、 （）和 （）时，表内数字应相应降低 倍；如改用 （） 、 （） 、 （）时，则表内数字应相应增高 倍，其余类推。