DB21∕T 2619-2016 传染性造血器官坏死病毒LAMP检测方法.pdf

ICS 67.120.30 B 50 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 26192016 传染性造血器官坏死病毒 LAMP 检测方法 Loop-mediated isothermal amplification detection method for Infectious haematopoietic necrosis virus 2016 - 04 - 27 发布 2016 - 06 - 27 实施辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 26192016 1 前 言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。 本标准主要起草单位：辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：肇慧君，胡强，张雪，刘钊，栾慎顺，李叶，胡传伟。 DB21/T 26192016 2 传染性造血器官坏死病毒 LAMP 检测方法 1 范围 本标准规定了传染性造血器官坏死病毒(Infectious haematopoietic necrosis virus， IHNV） 病原分离和环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification ，LAMP）检测方法。 本标准适用于IHNV病原的流行病学调查、诊断、检疫和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 SN/T 2123-2008出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3 符号代号和缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CPE：细胞病变(cytopathic effect) CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（hexadecyl trimethyl ammonium bromide） DEPC：焦炭酸乙二酯（diethypyrocarbonate） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid） HEPES：羟乙基呱嗪乙硫磺酸4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） LAMP：环介导恒温扩增（Loop-mediated isothermal amplification） Betaine：甜菜碱 Bst酶：Bst DNA聚合酶（大片段）Bst DNA polymerase(large fragment) AMV逆转录酶：AMV reverse transcriptase dNTP：脱氧核糖苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） 4 试剂、仪器和耗材 4.1 试剂 4.1.1 引物 选取特异性的 IHNV 的糖蛋白基因（G 基因）的序列，设计出能专一性鉴别传染性造血器官坏死病毒的特异性引物组，该引物组由如下四条引物组成： 外引物1（F3）：5-ATCGCGCTACCAGCTTCA-3 DB21/T 26192016 3 外引物2（B3）：5-TCATTGTAGAGGGCCAGGAT-3 内引物1（FIP）：5-GGTGGTGTTGTTTCCGTGCAATTTTTAATGGGAACGACCCTTTGG-3 内引物2（BIP）：5-GTCGCCCAGTACAAGATGAGCATTTTCTTGGATGGGGTACGGATTT-3 4.1.2 Bst DNA polymerase：8U/L，-20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.1.3 AMV 逆转录酶：15 U/L，-20保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 4.1.4 2reaction mixture：含 40mM Tris-HCL、20mM 氯化钾溶液、20mM 硫酸铵溶液、16mM 硫酸镁溶液、0.2%Tween-20、1.6M betaine（甜菜碱） 、2.8mM dNTPs。 4.1.5 Rnase inhibitor：40U/L。 4.1.6 显色液：浓度为 1000SYBR Green 。 4.1.7 阳性对照：IHNV 参考株。 4.1.8 EPC 细胞系：用 M199 培养液 25培养。 4.1.9 FHM 细胞系：用 M199 培养液 25培养。 4.1.10 乙醇：分析纯，使用前预冷到-20。 4.1.11 氯仿：分析纯。 4.2 仪器与耗材 4.2.1 倒置显微镜。 4.2.2 恒温培养箱。 4.2.3 普通冰箱和超低温冰箱。 4.2.4 组织研磨器（研磨器处理参见附录 B） 。 4.2.5 高速台式离心机：7000g。 4.2.6 水浴锅或加热模块：65+1和 100+1。 4.2.7 移液器：量程 0.5L10L，量程 10L100L，量程 100L1000L。 4.2.8 96 孔细胞培养板。 4.2.9 0.2 mL 和 1.5 mL 塑料离心管。 4.2.10 吸头，配套移液器待用。 4.2.11 计时器。 注：除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水；所有试剂均用无RNA酶的容器分装。 5 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作，应遵守SN/T 2123-2008的有关规定。 6 操作步骤 6.1 样本的采集与处理 6.1.1 采样 待检测鱼，体长小于 4cm 的鱼苗取整条鱼，体长 4cm6cm 的鱼苗取脑和内脏（包括肾），体长大于 6cm 的鱼取脑、脾和肾。按 GB/T 18088 的标准采样。 6.1.2 样品处理 DB21/T 26192016 4 用组织研磨器制备组织匀浆， 按 1:10 的最终稀释度用 M199 培养液稀释， 稀释液中含有 1000IU/mL青霉素和 1000g/mL 链霉素，于 15下孵育 2h4h 或 4下孵育 6h24h，7000g 离心 15min，收集上清液。 6.1.3 病毒分离 细胞传代使用胰酶-EDTA混合消化液（见附录A中A.1） 。对1:10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将1:10、1:100、1:1000的3个稀释度的上清液以适当体积分别接种到生长约24h EPC或FHM细胞单层的96孔板中，每孔的细胞单层最多接种100L稀释液。1520吸附0.5h1h后，加入M199细胞培养液，置于25培养。设2个阳性对照（接种IHNV参考株）和1个空白对照（未接种病毒的细胞） 。 阳性对照和待测样品都接种细胞后，7d内每天用倒置显微镜检查。如果接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变（CPE） ，应立即进行鉴定。如果除阳性对照细胞外，没有CPE出现，则在培养7d后还要用敏感细胞进行盲传。 传代时， 将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以7000g、4离心15min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，培养7d。每天用倒置显微镜检查。 如果阳性对照也未出现CPE，则应换用EPC或FHM细胞和待测样品重新进行病毒学检查。 6.2 IHNV 的 LAMP 检测 6.2.1 样品处理 将450L细胞病变悬液冻融后， 放入1.5mL的塑料离心管， 再加入450L CTAB溶液 （见附录A中A.3）并混匀，25作用2h。 6.2.2 核酸提取 在含有样品的塑料离心管中加入600L抽提液1（见附录A中A.4） ，用力混合至少30s。12000g离心5min，小心取上层水相（约800L） 。再加入700L抽提液2（见附录A中A.5） ，用力混合至少30s。12000g离心5min，小心取上层水相（约600L） 。再加入-20预冷的1.5倍体积的无水乙醇，倒置数次混匀后，-208h以上沉淀核酸。 12000g离心30min。 小心倒去上清液， 倒置于吸水纸上， 吸干液体。 37干燥20min或抽真空干燥，最后加10L DEPC水溶解后，作为LAMP反应模板。 或者选择等效的商品化试剂盒进行核酸的提取。 6.2.3 LAMP 反应体系 IHNV LAMP反应体系见表1。 表 1 IHNV LAMP 反应体系（25L） 组分 工作液浓度 加样量/L 2reaction mixture 2 12.5 外侧上游引物（F3） 5mol/L 1 外侧下游引物（B3） 5mol/L 1 内侧上游引物（FIP） 40mol/L 2 内侧下游引物（BIP） 40mol/L 2 Rnase inhibitor 40U/L 0.5 Bst DNA polymerase 8U/L 1 AMV逆转录酶 15U/L 0.35 DB21/T 26192016 5 RNA模板 1 DEPC水 3.65 6.2.4 LAMP 反应过程 按照表1所述配制反应体系：63恒温扩增45min，80 2min使酶失活，反应即结束。 6.2.5 空白对照、阴性对照、阳性对照设置 每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。 空白对照以DEPC水代替RNA模板。 阴性对照以不含IHNV样品的RNA代替RNA模板。 7 结果观察 在上述反应管中加入2L显示液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。显色液优选为荧光染料SYBR Green 。 8 结果判定 在空白对照和阴性对照反应管液体为橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下： 阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，该样品检测结果为阳性。 阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，该样品检测结果为阴性。 DB21/T 26192016 6 A A 附 录 A （规范性附录） 试剂的配制 A.1 胰酶-EDTA混合消化液 氯化钠（NaCL，分析纯） 0.8g 氯化钾（KCL，分析纯） 0.02g 磷酸二氢钾（KH2PO4，分析纯） 0.02g 磷酸氢二钾（K2HPO4，分析纯） 0.115g 乙二胺四乙酸（EDTA，分析纯） 0.02g 胰酶（分析纯） 0.1g 双蒸水 100mL 过滤除菌后分装备用。 A.2 培养液 M199培养基，按说明书的要求配制，然后加入10%的胎牛血清，抽滤除菌，4保存。开放系统使用时，加入过滤除菌的HEPES，使其在培养液中的终浓度为0.02mol/L。 A.3 CTAB溶液 按2%CTAB，1.4 mol/L NaCL，20.0 mmol/L EDTA，20.0 mol/L Tris-HCL pH7.5配制。用前家巯基乙醇到终浓度为0.25%。 A.4 抽提液1 酚/氯仿/异戊醇，用1.0 mol/L pH（7.9+0.2 ）Tris饱和过的重蒸酚：氯仿：异戊醇按25:24:1的比例混合，密闭避光保存。 A.5 抽提液2 氯仿/异戊醇，将氯仿和异戊醇按24:1的比例混合，密闭避光保存。 DB21/T 26192016 7 B B 附 录 B （资料性附录） 耗材去 RNA 酶的处理方法 本方法适用于本标准中所使用的研磨器、离心管和吸头。 使用前于180干燥8h以上，或用0.1%DEPC水浸泡处理。DEPC处理时，先在37浸泡2h，然后用灭菌水漂洗数次，于100干烤15min，去除器皿上残余的DEPC。 _