高效液相色谱串联质谱法同时测定畜禽粪便中多种抗生素方法的研究.pdf

书书书 年第 期浙江畜牧兽医櫇櫇櫇櫇櫇櫇櫇櫇殱殱殱殱试验研究收稿日期：基金项目：浙江省重点研发计划项目（新型兽药研制及耐药性控制技术研发 ）作者简介：侯轩（），男，江苏南京人，兽医师，硕士，主要从事兽药饲料畜产品质量安全工作。通信作者：陆春波，高级兽医师，主要从事兽药、饲料检测相关工作。高效液相色谱串联质谱法同时测定畜禽粪便中多种抗生素方法的研究侯轩，陈凯，裘丞军，虞一聪，王彬，吴望君，陆春波（浙江省动物疫病预防控制中心，浙江 杭州 ）摘要：建立了高效液相色谱 串联质谱（）同时检测畜禽粪便中四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类 种化合物的方法。畜禽粪便冷冻干燥粉碎，固相萃取柱净化，用 进行检测。种化合物在 浓度范围内线性关系良好（），回收率在 之间，日内变异系数范围为 ，日间变异系数范围为 ，检测限为 ，定量限为 。本方法操作简便，灵敏度高，适用于猪和鸡粪便中 种化合物的同时测定。关键词：畜禽粪便；四环素类；磺胺类；喹诺酮类；大环内酯类；高效液相色谱 串联质谱法中图分类号：文献标识码：文章编号：（）目前，畜禽粪便中检测抗生素的方法主要有高效液相色谱法 、液相色谱串联质谱法 ，但关于同时检测四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类药物的方法鲜有报道。本研究采用高效液相色谱 串联三重四极杆质谱法对四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类 种化合物进行同时检测，为畜禽粪便中抗生素残留有效监控、粪污无害化处理及资源化利用提供重要的技术支撑。材料与方法 试验仪器高效液相色谱仪、串联三重四极杆质谱仪、冷冻干燥机、电子天平、氮吹仪（）；冷冻离心机、振荡器等。试剂 种化合物标准品（磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺甲唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺二甲嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺喹啉、恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、丹诺沙星、双氟沙星、洛美沙星、氟甲喹、泰乐菌素、替米考星、土霉素、四环素、金霉素、多西环素）均购于 公司，纯度 。试验方法 仪器条件 色谱条件用十八烷基键合硅胶色谱柱（），柱温 ，进样量 ，甲酸水溶液为流动相 ，乙腈为流动相 ，按表 进行梯度洗脱，流速为 。表 梯度洗脱程序表时间（）甲酸水（）乙腈（）质谱条件电喷雾源正离子模式（），多反应监测模式（）；离子源电压：，辅助加热气温度：，气帘气流速：；离子源气流流速：为 ，为 ；种化合物的 条件参数见表 。溶液配制预先配制 氢氧化钠溶液、甲酸水溶液、提取液。标准品储备液配制分别精密称取四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类 种化合物约 ，置 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，分别配制成 标准品储备液。浙江畜牧兽医 年第 期表 种化合物的 条件参数化合物名称母离子 子离子 去簇电压碰撞室入口电压碰撞能量 碰撞室出口电压磺胺氯哒嗪 磺胺嘧啶 磺胺甲唑 磺胺间甲氧嘧啶 磺胺甲基嘧啶 磺胺对甲氧嘧啶 磺胺甲氧哒嗪 磺胺二甲嘧啶 磺胺间二甲氧嘧啶 磺胺喹啉 恩诺沙星 环丙沙星 沙拉沙星 氧氟沙星 诺氟沙星 培氟沙星 丹诺沙星 双氟沙星 洛美沙星 氟甲喹 泰乐菌素 替米考星 年第 期浙江畜牧兽医续表 化合物名称母离子 子离子 去簇电压碰撞室入口电压碰撞能量 碰撞室出口电压土霉素 四环素 金霉素 多西环素 注：为定量离子 混合标准品中间工作液配制分别吸取适量的 种化合物标准品储备液，置于 棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，使之成 的混合标准品中间工作液。混合基质匹配工作液配制取鸡、猪不含待测化合物的空白粪便，加入混合标准品中间工作液适量，按提取和净化步骤处理后，用 甲酸水复溶分别制成浓度为 、的混合基质匹配工作液。样品预处理 样品的制备取新鲜粪便约 ，以下冷冻干燥 后，粉碎或研磨，过 孔径的分析筛，装入密封容器中，试样在 干燥避光保存备用。样品的提取取粉碎后的粪便 （），置于 的离心管中。加入 缓冲液，振荡涡旋 ，超声 后，离心 后，取全部上清液作为备用液 。残渣用 乙酸乙腈 重复提取一次，转移上清液为备用液 。样品的净化将 固相萃取柱依次用甲醇 和水 活化，将全部备用液过柱，控制流速在 以下，用水 淋洗，抽干，氨水化甲醇洗脱，收集洗脱液。洗脱液与备用液 混合后，水浴条件下，氮气吹干，用 甲酸水溶液 溶解残余物，溶液经 过微孔滤膜，上机测定。结果与分析 质谱条件的优化以 甲酸水 乙腈 甲醇 （）为基准流动相，采用流动注射泵连续进样，对 种药物的质谱条件进行优化，在正离子模式下进行全扫描，确定各种药物在多反应监测模式下信号采集的特征离子对（表 ）。液相条件的优化为了获得较好的色谱峰型，本研究对色谱柱及流动相进行了优化。采用“”所述色谱柱及流动相条件，色谱行为良好，能满足检测要求。从空白样品、基质加标样品的 色谱图（图 ）可见，在待测药物出峰的位置没有杂质干扰，各化合物实现了良好的基线分离及响应。图 空白猪粪便基质溶液总离子流图图 空白鸡粪便基质溶液总离子流图浙江畜牧兽医 年第 期图 种化合物猪粪便基质加标溶液总离子流图（）图 种化合物鸡粪便基质加标溶液总离子流图（）标准曲线、检出限及定量限按 处理空白样品后，高效液相色谱串联质谱检测，以峰面积作为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。由表 可知，在浓度为 浓度范围内，线性关系良好，取信噪比 的样品浓度为方法检出限（），取信噪比 的样品浓度为方法定量限（）。表 种化合物的线性方程与相关系数药物名称线性方程相关系数（）检测限（）定量限（）磺胺氯哒嗪 磺胺嘧啶 磺胺甲唑 磺胺间甲氧嘧啶 磺胺甲基嘧啶 磺胺对甲氧嘧啶 磺胺甲氧哒嗪 磺胺二甲嘧啶 磺胺间二甲氧嘧啶 磺胺喹啉 恩诺沙星 环丙沙星 沙拉沙星 氧氟沙星 诺氟沙星 培氟沙星 丹诺沙星 双氟沙星 洛美沙星 氟甲喹 泰乐菌素 替米考星 土霉素 四环素 金霉素 多西环素 年第 期浙江畜牧兽医 回收率与精密度在 个不同浓度添加水平下进行添加回收实验，每个浓度设 个平行，重复 次。计算添加回收率及变异系数，结果见表 。表 猪粪中 种化合物的回收率（）药物名称添加浓度（）平均回收率（）日间变异系数（）日内变异系数（）磺胺氯哒嗪 磺胺嘧啶 磺胺甲唑 磺胺间甲氧嘧啶 磺胺甲基嘧啶 磺胺对甲氧嘧啶 磺胺甲氧哒嗪 磺胺二甲嘧啶 磺胺间二甲氧嘧啶 磺胺喹啉 恩诺沙星 环丙沙星 沙拉沙星 氧氟沙星 表 鸡粪中 种化合物的回收率（）药物名称添加浓度（）平均回收率（）日间变异系数（）日内变异系数（）磺胺氯哒嗪 磺胺嘧啶 磺胺甲唑 磺胺间甲氧嘧啶 磺胺甲基嘧啶 磺胺对甲氧嘧啶 磺胺甲氧哒嗪 磺胺二甲嘧啶 磺胺间二甲氧嘧啶 磺胺喹啉 恩诺沙星 环丙沙星 沙拉沙星 氧氟沙星 实际样品检测应用建立的分析方法，对浙江省内 家养殖场采集的 份生猪粪便、份鸡粪便进行测定，结果表明，大类化合物在猪、鸡粪便中均有不同程度检出。四环素类检出含量范围在浙江畜牧兽医 年第 期 之间；磺胺类检出含量范围在 之间；喹诺酮类检出含量范围在 之间；大环内酯类检出含量范围在 之间。整体来看，猪粪便中 种化合物检出含量高于鸡粪便中检出含量。本方法能满足对畜禽粪便中 种化合物有效监控的需要。讨论 流动相梯度洗脱程序的优化因待测 种化合物中，磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶为同分异构体，分子式均为 ，其母离子 均为 ，定量离子 为 ，单单通过质荷比很难将三种化合物区分，本研究通过对不同流动相条件的摸索，确定了流动相梯度洗脱程序（表 ），对待测化合物进行采集分析。由图 可见，磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶的保留时间分别为 、，三种化合物在该流动相条件下得到有效分离，且峰形锐利，满足检测要求。图 磺胺对甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺间甲氧嘧啶保留时间 前处理方法的优化夏天娇 、石奥 等研究粪便中四环素类药物时，采用 溶液进行提取。主要原因是粪便中的 、等金属离子，可与四环素类化合物的酚羟基，形成难溶的螯合物 。溶液可有效抑制基质中金属离子对目标化合物的络合反应 。但仅使用 溶液提取，喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类药物回收率较差，故本研究选择有机相溶剂进行二次提取。在有机相溶剂选择上，对甲醇、乙腈、乙酸乙腈进行了比较，研究发现当乙腈作为提取液时，相比甲醇，可有效降低上机液中的蛋白质类杂质；相对纯乙腈提取，乙酸乙腈提取，可提高喹诺酮类药物的回收率。故本研究采取 溶液提取，小柱净化，乙酸乙腈进行二次提取的前处理方法。结果表明，种化合物回收率在 之间，符合检测要求。样品的基质效应考察基质效应 是影响 分析复杂药物时重要的因素之一。基质效应（）是根据纯标准溶液与基质标准溶液的响应强度进行评估，考察某水平下，标准溶液的响应强度 和同条件下基质标准溶液的响应强度 的 关 系，具 体 公 式 如 下：（），其中，为空白基质提取液的响应强度。值介于 和 之间认为无明显的基质效应，大于 表明是基质增强，小于 表明是基质抑制。本研究通过比较标准品溶液和猪粪便基质匹配标准溶液（浓度 ）对目标物响应值的影响，来确定基质对目标物有无基质效应，结果见图 。图 猪粪便基质效应（）（下转第 页）年第 期浙江畜牧兽医监督执法的职能归属到综合行政执法队。一旦在检疫过程中发现有将患病生猪、口蹄疫康复猪、替换耳标洗白“黑猪”等进行申报检疫的，应与农业行政执法队联合，严厉查处，树立典型，从重处罚。对于造成疫情传播等重大影响后果的，追究有关法律责任。与实验室联动，前置抗体检测是否进行强制免疫、强制免疫是否达标，可以进行实验室抗体检测。虽然检疫管理办法没有将实验室检测抗体等相关的条件作为检疫出证硬性前置条件。下一步可以考虑将平时的监测与飞检结合，对于强制免疫抗体不达标的，禁止出具检疫证明。对于伪造防疫信息的养殖户，报执法队处置。加强检疫作风建设加强检疫人员的警示教育工作，强化兽医队伍管理。定期开展职业道德、法律意识、服务观念、清正廉洁为主要内容的思想教育，打牢思想基础，增强自觉抵制腐败。加强制度建设，强化检疫的权力监督，杜绝“隔山开证”、“人情证”等情况的出现，确保公正公开、透明高效地行使检疫权。不断提升检疫人员业务水平动物检疫工作专业性强，需要有一定的专业背景，且要不断地进行业务学习，包括岗前培训、在岗培训、学历学位教育、线上考试等 个方面的内容，以调整完善官方兽医的管理要求。检疫人员对检疫业务要烂熟于心，要严格执行 动物防疫法、动物检疫管理办法、生猪产地检疫规程 等有关规定，对于生猪临床健康情况、畜禽标识、养殖台账、防疫档案等内容要掌握到位。提升动物协检员工资待遇当前，基层动物协检员从事生猪产地检疫工作，经常跟生猪打交道，脏、臭是常态，还存在感染人畜共患病的职业风险，以及工资待遇低等情况。这也是行业普遍的问题，提高检疫人员的工资待遇，对稳定检疫队伍，保障动物检疫工作规范、有序开展具有重要意义。思考动物检疫工作的检疫对象是 动物防疫法 第三条第三款所称动物疫病，包括传染病和寄生虫病。笔者从生猪的产地检疫入手，阐述了基层在开展生猪产地检疫过程中存在的风险及对策。相信通过打击养殖户（猪贩子）违法违规行为，完善动物检疫法律法规，优化动物检疫制度，联动协同各部门间业务管理体系，强化检疫人员素质与业务，提高协检人员的待遇等角度、多方面去化解当前生猪产地检疫工作可能存在的风险，能最大程度地保障生猪产业发展，保障猪肉食品安全和公共卫生安全欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍。（上接第 页）从图 可见，本研究中大部分化合物呈现基质抑制现象，有可能是因为粪便样品基质较为复杂，经水相和有机相提取后，上机液中杂质在 离子源作用下与目标化合物竞相离子化，降低了目标化合物的响应。因此本研究采用基质加标校准曲线进行定量计算，以减小基质效应对目标化合物定量的影响。结论本研究建立的畜禽粪便中四环素类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类 种化合物的检测方法，回收率在 之间，日内变异系数范围为 ，日间变异系数范围为 。本方法操作简便，灵敏度高，重现性强，符合兽药残留分析性能要求，可用于日常样品分析。参考文献 王佳宁，徐永平，李晓宇，等 畜禽粪便抗生素残留及其对环境的影响 畜牧与兽医，（）：夏天骄，夏训峰，徐东耀，等 基于固相萃取 高效液相色谱法的畜禽粪便中四环素类抗生素残留量检测 安全与环境学报，（）：周悦榕，李丹妮，吴剑平，等 超高效液相色谱 电喷雾电离 串联质谱法测定猪粪便中 种抗生素残留的基质效应研究 分析测试学报，（）：石奥，张建淼 固相萃取 超高效液相色谱 串联质谱法同时测定畜禽粪便中的 种抗生素残留 理化检验 化学分册，（）：李俊锁，邱月明，王 超 兽药残留分析 上海：上海科学技术出版社，周炜，郭炫君，王武强，等 法分析生猪异位发酵床垫料中 大类兽用抗菌药物残留及蓄积趋势 中国兽药杂志，（）：