高效液相色谱测定不同地域林下参单体皂苷含量的实验分析.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 35 高效液相色谱测定不同地域林下参单体皂苷含量的实验分析 朱键勋 刘玉翠 肖井雷 姜大成（通讯作者）长春中医药大学药学院，吉林 长春 130117 摘要：摘要：目的 探究使用高效液相色谱（HPLC）方法测定下不同地域林下参（Panax ginseng）中单体皂苷含量的差异，并分析该方法的可行性。方法 收集来自 6 个地域（黑龙江省双鸭山市、辽宁省恒仁县、新宾县、吉林省榆林镇、靖宇县、抚松县）针阔混交林荫坡下的林下参样品，并制备样品提取液，采用 HPLC 分析法，选用合适的色谱柱和流动相体系，对样品进行分析，通过建立外标法校准曲线，测定出样品中各个单体皂苷的含量。结果 6个产地人参皂苷 Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1，在 35min 内基线分离，线性良好（r=0.999）。不同地域下的林下参样品中单体皂苷的含量存在一定的差异，其中，抚松县林下参单体皂苷 Rg1、Rf 含量最高。这可能是由于地域环境、土壤条件、气候等因素所导致的。结论 通过 HPLC 分析不同地域林下参样品中的单体皂苷含量，能够准确获得关于其化学成分的定量信息。该方式对于了解不同地域林下参的质量差异、选择合适的采购源以及优化利用林下参的方法具有重要意义。关键词：关键词：高效液相色谱；不同地域；林下参；单体皂苷含量 中图分类号：中图分类号：R284R284 林下参（Panax ginseng），是一种重要的草本植物，被广泛应用于中药和保健品领域1。其根部含有丰富的活性成分，尤其是单体皂苷，被认为具有多种药理活性和保健功效。随着对林下参的研究日益深入，越来越多的关注被投入到了林下参的质量评估和地域差异方面2。相关文献指出3，不同地域的生长环境和土壤条件对林下参的生长和活性成分含量可能产生显著的影响。因此，了解不同地域林下参中单体皂苷含量的变化趋势对于保证其质量和有效利用至关重要。高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分析技术，已被广泛应用于药物和天然产物的定量分析4。有关研究表明5，HPLC 分析法具有高灵敏度、高分辨率和高重复性的优势，适用于单体皂苷的分离和测定。通过 HPLC 分析不同地域下林下参样品中的单体皂苷含量，能够获得更为可靠的数据，为林下参的质量评估和合理利用提供科学依据。基于此，本实验决定探究 HPLC 技术对于不同地域林下参样品中的单体皂苷进行测定的可行性，并对比不同地域之间林下参的差异。现将该实验结果作如下报告。1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 仪器：高效液相色谱仪（厂商：赛默飞；型号：UltiMate 3000,Accela,Vanquish,Dionex）；超声波清洗器（厂商：Elma；型号：P-series,S-series,X-tra）。试剂：人参皂苷对照品 Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1，中国药科大学药学实验设备公司。实验药品：纯净水、国产分析纯、甲醇、乙腈。1.2 实验样品 林下参分别取自黑龙江省双鸭山市、吉林省榆林镇、靖宇县、抚松县、辽宁省新宾县、恒仁县 6 个产地针阔混交林的下，经鉴定均为 10a 林下参，每组 9 株。1.3 方法 1.3.1 制备对照品溶液 称取 Rbl（4.65mg）、Rb2（5.78mg）、Rb3（2.13mg）、Rc（6.15mg）、Rd（6.27mg）、Re（5.23mg）、Rf（4.82mg）、Rg1（5.58mg），将其置入 15ml 容量瓶中，同时加入甲醇溶液进行定容，摇匀后分别得到浓度为 465、578、213、615、627、523、482、558g/ml 的母液，精密量取上述混合对照品溶液 0.6、0.3、0.15、0.1、0.03、0.02、0.05、0.1ml，分别置于 1ml 量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀后获得对照品溶液，置于 4环境保存。中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 36 1.3.2 制备实验样本溶液 精密称取不同地域人参药材粉末 0.15g，置入具塞锥形瓶中，加入甲醛 40ml，超声 30min，将至室温，补足失重，摇匀后过 0.55m 滤膜，获得滤液即为样本溶液，置于 4环境保存。1.3.3 色谱条件 色 谱 柱：Agilent Zorbax SB-c18（3.0mm 100mm,3.5um）；流动相为乙腈（A）和水（B）,梯度洗脱 A 相含量随时间的变化：19-22(0-13min)，19-28(15 min)。28(20-25 min)，28-38(24-35 min)，36-54(35 min)，流速 0.5 ml/min；检测波长 205 nm；柱温 24；1.3.4 制作色谱图 按照出峰顺序，8 中人参皂苷 Rg1、Re、Rf、Rbl、Rc、Rb2、Rb3、Rd 的保留时间分别为 14.729、15.694、21.342、27.996、31.004、31.272、31.656、33.453min，根据对照品溶液的色谱图中的 8 个峰的相关系数计算系统适应性，理论塔板数分别为：12 524、16 011、154 333、87 897、167 287、223 358、243 429、287 984；分离度为：1.97、17.24、16.35、4.29、4.58、1.72、6.09；脱尾因子为：1.017、0.878、0.927、0.924、0.939、0.971、0.945、0.986。1.4 质量控制 1.4.1 精密度测试 将制备好的对照品溶液中的 1、4、6 三个点作为低、中、高三个浓度点，连续进样 3 次/d，连续进样3d。根据峰面积观察日内精密度和日间精密度。8 种人参皂苷日内精密度低浓度点 RSD%均1.8%，中浓度点RSD%1.6%，高浓度点 RSD%1.6%；日间精度低、中浓度点 RSD%均1.8%，高浓度点 RSD%1.6%，说明该方法精密度较为准确。1.4.2 稳定性测试 测定 0、2、4、6、8、12、24h 样品溶液的人参皂苷峰面积，鉴定该方法的稳定性。Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1的峰面积 RSD%分别为 1.62%、1.78%、1.55%、0.79%、1.21%、1.43%、1.72%、1.92%。该结果显示样品溶液在 1d 内具有稳定性。2 结果 2.1 对照品溶液线性关系 将制备的对照品溶液按照设定的色谱条件依次连续进样，分别重复 3 次，对照品溶液浓度（X，ug/ml）对峰面积（Y）进行线性回归，呈现良好的线性关系，见表 1。表 1 对照品皂苷溶液线性关系（x s）Component Regression equation Linear range B/（gml-1）r Rg1 Y=4.653X+0.139 5.51-282.0 0.9999 Re Y=4.524 X-1.698 5.19-261.0 0.9999 Rf Y=5.497X+1.566 4.81-239.0 0.9999 Rbl Y=3.869X-0.397 4.71-229.0 0.9999 Rc Y=3.547 X-0.456 6.23-314.0 0.9999 Rb2 Y=4.264X-0.211 5.67-286.0 0.9999 Rb3 Y=4.538X+1.096 2.14-105.6 0.9999 Rd Y=4.858 X+0.821 6.34-315.5 0.9999 2.2 不同地域人参皂苷含量测定 按照设定的色谱条件，将不同地域的林下参样品溶液依次进样，分析计算样品中的人参皂苷含量。见表2。表 2 不同地域林下参皂苷含量测定wB/（mgg-1），（s）Source 双鸭山 榆林镇 靖宇县 抚松县 新宾县 恒仁县 Rg1 2.4530.016 2.4610.017 2.7280.021 3.1280.016 2.7820.020 2.7520.018 Re 1.2670.012 1.2390.006 1.4130.022 1.4260.008 1.3810.007 1.4390.010 Rf 0.6210.006 0.6240.004 0.6510.005 0.7820.010 0.7110.008 0.7210.004 Rbl 3.7850.021 3.7710.021 4.6850.026 4.7990.024 4.7910.012 4.7620.016 Rc 2.4820.013 2.5610.015 3.2250.005 3.2220.008 3.2430.007 3.2410.011 Rb2 2.0650.016 2.1330.006 2.7100.007 2.7320.016 2.7260.016 2.4630.014 Rb3 0.2210.002 0.2180.003 0.3760.004 0.3330.004 0.3410.005 0.3390.003 Rd 0.7170.00.7270.00.9630.00.9620.00.9340.00.9130.0中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 37 06 08 05 04 06 04 3 讨论 人参作为一种重要的中药材，其主要有效成分为皂苷类化合物，其中单体皂苷是其中的重要成分。林下参是在林下环境中生长，同时在不同地域生长环境下可能出现不同的生物活性和药理特性6。单体皂苷在人参中的具有重要的生物活性，能够起到抗氧化、抗炎、抗肿瘤和免疫调节的作用7。据相关研究分析8，单体皂苷含量的变化可能导致林下参在药理活性和药效上的差异。而不同地域的气候、土壤调节和生态环境可能会对林下参的生长和化学成分产生影响，因此进一步了解不同地域林下参单体皂苷含量的差异，有助于确定最适宜的地域进行人参种植或采集。在本研究中，采用高效液相色谱对对照品溶液的不同浓度进行测定，并记录每个浓度对照品溶液在相应条件下的峰面积，进行线性回归分析。通过对照品溶液线性关系分析可以得出，高效液相色谱在分析人参单体皂苷含量的实验分析中具有可靠性和准确性。在该研究中，分别选用了 6 个产地的林下参作为研究对象，其中抚松县林下参中的 Rg1、Rf 含量明显最高，这可能是由于海拔、积温、降水量以及光照因素的不同所导致的，因此以研究选用的 6 个产地来看，抚松县显然更适合林下参的种植。综上所述，高效液相色谱分析人参单体皂苷含量符合精密度测试和稳定性测试的标准，它能将人参皂苷 Rbl、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1在较短时间内进行分，且该方法便捷、稳定、可靠，值得研究推广。参考文献 1肖涵,张群,王玮铨,等.林下参根皂苷类化合物优化 提 取 与 鉴 定 J.食 品 研 究 与 开发,2019,40(24):132-137.2Wang CQ,Yi LW,Zhao L,Zhou YZ,Guo F,Huo YS,Zhao DQ,Xu F,Wang X,Cai SQ.177 Saponins,Including 11 New Compounds in Wild Ginseng Tentatively Identified via HPLC-IT-TOF-MSn,and Differences among Wild Ginseng,Ginseng under Forest,and CultivatedGinseng.Molecules.2021Jun2;26(11):3371.doi:10.3390/molecules26113371.PMID:34199646;PMCID:PMC8199768.3孙海,严珺,刘惠军,等.桓仁地区林下参土壤中重金属空间变异分析J.特产研究,2020,42(4):9.4周春元,许世泉,闫梅霞.林下参内生球毛壳菌 FS-01对 人 参 病 原 真 菌 的 抑 制 作 用 J.广 西 植物,2020,40(9):8.5苏欣然,刘春莹,王越,等.两种林下参各部位皂苷的组成成分J.大连工业大学学报,2018,37(1):4.6阮晓佳,郜玉钢,赵岩,等.不同林型 产地 参龄及坡向对林下参20种单体皂苷含量的影响J.食品科学,2018,39(24):195-202.7Chen W,Balan P,Popovich DG.Comparison of Ginsenoside Components of Various Tissues of New Zealand Forest-Grown Asian Ginseng(Panax Ginseng)and American Ginseng(Panax Quinquefolium L.)J.Biomolecules,2020,10(3):372.8陈彦霏,张善铭,许永华,等.Rg1 皂苷单体对人参锈腐病菌(Ilyonectriarobusta)的趋化作用及酶活性的影响J.东北林业大学学报,2022(002):050.