生化药物制造工艺糖类药物.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,（一）糖类药物的分类,糖类药物,种类繁多,，其分类方法也有多种，按照含有,糖基数目,不同可分为以下几类。,（1）单糖类：,如葡萄糖、果糖、氨基葡萄糖和维生素C等。,（2）低聚糖类,：如蔗糖、麦芽乳糖、乳果糖等。,（3）多糖类,：多糖又有多种，根据其,来源不同,又可分为：,来源于植物的多糖,，如黄芪多糖、人参多糖、刺五加多糖；,来源于动物的多糖,，如肝素、透明质酸、硫酸软骨素等；,来源于微生物的多糖,，如香菇多糖、猪苓多糖、灵芝多糖、云芝糖肽等。,（4）糖的衍生物：,如1，6二磷酸果糖、6磷酸葡萄糖、磷酸肌醇等。,（二）多糖的药理活性,多糖具有十分广泛的,药理生理作用,：,1、抗肿瘤和免疫促进活性,多糖对,免疫功能,具有重要的调节作用，从,多个层次多个途径激活机体免疫系统,。包括对各种,免疫细胞的调节，对细胞因子的调节以及对补体的调节,等。,香菇多糖已用于临床，另外灵芝多糖、地黄多糖、冬虫夏草多糖、海带多糖、微藻多糖等也具有,抗肿瘤活性,。,2、抗病毒活性,多糖类在结构上与细胞表面,糖胺聚糖类似，竞争抑制病毒与细胞结合,，同时又是许多细胞表面分子的,模拟配体，能直接与细胞结合，阻碍病毒的吸附。,3、抗凝血活性,肝素,是天然抗凝剂，带有负电荷。,甲壳素、硫酸化,昆布多糖、海带多糖,均具有体内外,抗凝血作用,。,芦荟多糖、黑木耳多糖,等也具有肝素样的,抗凝血作用,。,4、抗氧化活性,多糖可通过,提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质过氧化,，从而,保护生物膜,。,5、抗感染作用,多糖,可以提高机体组织细胞对,细菌、原虫、病毒和真菌感染,的抵抗力。如甲壳素对,皮下肿胀有治疗作用,，对皮肤伤口有,愈合作用,。,6、降血脂、抗动脉粥样硬化作用,类肝素、硫酸软骨素、小分子量肝素等具有,降血脂、降血胆固醇、抗动脉粥样硬化作用,，用于防治冠心病和动脉硬化。,7、抗辐射、抗突变,随着人类对多糖研究的不断深入。将会发现,多糖,更多的作用和用途。,二、糖类药物制备的一般方法,（一）单糖及其衍生物的制备,游离,单糖及小分子寡糖易溶于冷水及温乙醇,，单糖、双糖类、三糖类、四糖类以及多元醇类。,可以用水或在中性条件下以,50乙醇,为提取溶剂，也可以用,82乙醇，在7078下回流提取,。,植物材料磨碎经,乙醚或石油醚脱脂,，拌加碳酸钙，（药材中,拌入碳酸钙或氢氧化钡,，以,防止酶和有机酸,的影响。）以50乙醇温浸，用,中性醋酸铅,去,杂蛋白,及其他杂质，铅离子可,通H,2,S除去,，再浓缩。,醇液经活性炭,脱色、浓缩、冷却,、,滴加乙醚，或置于硫酸干燥器,中旋转，析出结晶。,单糖或小分子寡糖也可以在提取后，用,吸附层析法或离子交换法进行纯化,。,（二）多糖的分离与纯化,多糖可来自,动物、植物和微生物,。来源不同，提取分离方法也不同。,植物体内,含有,水解多糖衍生物的酶,，必须,抑制或破坏酶的作用,后，才能制取天然存在形式的多糖。,因,温度升高,，使多糖受到,内源酶的作用,。,速冻冷藏,是,保存提取多糖材料,的有效方法。,提取方法,依照不同种类的多糖的,溶解性质,而定。,酸性黏多糖,常含有,氨基己糖、己糖醛酸以及硫酸基,等多种结构成分，且常,与蛋白质结合,在一起，提取分离时，通常先用,蛋白酶或浓碱、浓中性盐解,离蛋白质与糖的结合键后，用水提取。,1、多糖的提取,提取多糖时,，一般需先进行,脱脂,，以便多糖释放。方法是将,材料粉碎,，用甲醇或,1：1乙醇乙醚混合液,，加热搅拌13h，也可用,石油醚脱脂,。,动物材料,可用,丙酮脱脂、脱水处理,。,多糖的提取方法主要有以下几种。,（1）难溶于冷水、热水，可溶于稀碱液者,对,甘露聚糖、半乳聚糖,等能形成,硼酸络合物的多糖,，可加入,硼砂,，此法可得相当纯的物质。,（2）易溶于温水、难溶于冷水和乙醇者,材料用,冷水浸过,，用热水提取，必要时可,加热至8090,搅拌提取，提取液用,正丁醇与三氯甲烷混合液,除去杂蛋白（或用,三氯乙酸除杂蛋白,），透析后用,乙醇沉淀,得多糖。,（3）黏多糖,因大部分,黏多糖与蛋白质结合,于细胞中，因此需用,酶解法或碱解法,使,糖蛋白质,间的,结合键断裂,，促使,多糖释放,。,碱解法,可以防止黏多糖分子中,硫酸基,的水解破坏，也可以同时用,酶解法,处理组织。,碱解法,。多糖与蛋白质结合的,糖肽键对碱不稳定,，故可用碱解法使糖与蛋白质分开。,黏多糖分子上的,硫酸基一般对碱较稳定,，但若,硫酸基与邻羟基处于反式结构,或,硫酸基,在,C 3或C 6,上，此时易发生,脱硫作用,。因此对这类多糖,不宜用碱解法提取,。,酶解法。,蛋白酶水解法已逐步取代碱提取法而成为提取多糖的最常用方法。,鉴于蛋白酶不能,断裂糖肽键及其附近的肽键,，因此成品中会保留较长的肽段。为除去长肽段，常可与,碱解法合用,。,2、多糖的纯化,多糖的纯化方法很多，但必须根据,目的物的性质及条件,选择合适的纯化方法。一种方法不易得到理想的结果，因此必要时应考虑合用几种方法。,（1）乙醇沉淀法,乙醇沉淀法是制备黏多糖的最常用手段。乙醇的加入，改变了溶液的极性，导致糖溶解度下降。如使用充分,过量的乙醇，黏多糖浓度少于01,也可以,沉淀完全,。,向溶液中加入一定浓度的盐，如,醋酸钠、醋酸钾、醋酸铵或氯化钠,有助于使黏多糖从溶液中析出，盐的,最终浓度5即足够,。使用,醋酸盐的优点,是在乙醇中其溶解度更大，即使在,乙醇过量,时，也不会发生这类盐的,共沉淀,。,加完乙醇，搅拌数小时，以保证多糖,完全沉淀,。沉淀物可用,无水乙醇、丙酮、乙醚,脱水，真空干燥即可得,疏松粉末状,产品。,（2）分级沉淀法,不同多糖在不同浓度的,甲醇、乙醇或丙酮,中的,溶解度不同,，因此可用不同浓度的,有机溶剂分级沉淀,分子量大小不同的黏多糖。,在,Ca,2,、,Zn,2,十,等二价金属离子的存在下,，采用,乙醇分级分离,黏多糖可以获得最佳效果。,（3）季铵盐络合法,黏多糖,与一些,阳离子表面活性剂,如十六烷基,三甲基溴化铵,和十六烷基,氯化吡啶（CPC,）等能形成,季铵盐络合物,。,这些络合物在低离子强度的水溶液中不溶解，在离子强度大时，这种络合物可以,解离、溶解、释放,。,无机盐浓度,（临界盐浓度）主要取决于,聚阴离子的电荷密度,。黏多糖的,硫酸化程度,影响其,电荷密度,。,季胺盐的沉淀能力,受其烷基链中的,亚甲基数,的影响，还可以用,不同种季铵盐的混合物,作为酸性黏多糖的,分离沉淀剂,。,应用季铵盐沉淀多糖是分级分离复杂黏多糖的最有用方法之一,。,（4）离子交换层析法,黏多糖由于具有,酸性基团,如,糖醛酸和各种硫酸基,，在溶液中以聚阴离子形式存在，因而可用,阴离子交换剂,进行交换吸附。,洗脱时可以逐步提高盐浓度如,梯度洗脱,或分步阶段洗脱。,（5）凝胶过滤法,凝胶过滤法可根据多糖,分子量大小不同,进行分离。,此外，,区带电泳法、超滤法及金属络合法,等在多糖的分离纯化中也常采用。,3、溶液中多糖浓度的测定,（1）蒽酮硫酸比色法测定糖含量,糖类遇浓硫酸,脱水生成,糠醛或其衍生物,，可与,蒽酮,试剂结合产生,颜色反应,，反应后溶液呈,蓝绿色,，于620nm处有最大吸收，,吸收值与糖含量呈线性关系,。,标准曲线：,以“0”管作空白对照，,620nm处的吸光度,，以,吸光度对葡萄糖浓度作图得标准曲线,。,取样品液,0.1ml,，按上述步骤操作，测光密度，以,标准曲线计算,多糖含量。,（2）3，5二硝基水杨酸（DNS）比色法测定还原糖,在碱性溶液中，DNS与还原糖共热后被还原成棕红色氨基化合物,，在一定范围内,还原糖的量,与反应液的颜色强度呈,比例关系,，利用比色法可测定样品中的含糖量。,（3）苯酚硫酸比色法,苯酚硫酸试剂,可与多糖中的,己糖、糖醛酸,起,显色反应,，在,490nm处有最大吸收,，吸收值与糖含量呈线性关系。,（4）葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖,葡萄糖氧化酶,专一氧化,葡萄糖,，生成,葡萄糖酸和过氧化氢,，再利用,过氧化物酶,催化,过氧化氢,氧化某些物质如,邻甲氧苯胺,使其从,无色转变为有色,，通过,比色法计算,葡萄糖含量。,葡萄糖溶液中,葡萄糖和葡萄糖存在着动态平衡,，随着葡萄糖的氧化，最终所有,型全部转变成型被氧化,。,（5）Nelson法,还原糖,将,铜试剂,还原生成,氧化亚铜,，在,浓硫酸,存在下与,砷钼酸生成蓝色溶液,，,在,560nm,下的吸收值与糖含量呈线性关系。,4、纯度检查,多糖的纯度只代表某一多糖的,相似链长的平均分布,，,通常所说的多糖纯品也是指具有一定分子量范围的均一组分,。,多糖纯度的鉴定,通常有以下几种方法：,（1）常压凝胶层析法,凝胶层析法,是根据在凝胶柱上,不同分子量的多糖与洗脱体积成一定关系,的特性来进行的。,选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的保证。,（2）高效凝胶渗透色谱法,HPLC法,具有快速、高分辨率和重现性好的优点，因此得到越来越多的应用。,用于HPLC的凝胶柱均为商品柱，其填料有,疏水性的，也有亲水性的,，而且每根柱的孔径不同，,分离分子量的范围亦不同,。,选用哪一种性质的填料和用多大的,排阻限和渗透限,，主要取决于被分离,溶质的性质和可能的分子量大小,。,多糖的检测不采用,柱后衍生化方法,，而是采用,直接检测,。,（3）比旋度法,不同的多糖具有,不同的比旋度,，在不同浓度的乙醇中具有,不同溶解度,。,如果多糖的水溶液经,不同浓度的乙醇沉淀,所得的沉淀具有,相同比旋度,，则该多糖为,均一组分,。,（4）超离心法,如果多糖在离心力场作用下形成单一区带，说明多糖微粒,沉降速度相同,，,表明其分子的密度、大小和形状相似,。,三、重要糖类药物的制备,糖类药物品种繁多，现根据其来源、性质及工艺特点不同，主要介绍具有代表性的几个重要品种的生产工艺。,（二）1，6-二磷酸果糖,（1)、结构与性质,1，6-二磷酸果糖,是果糖的1，6-二磷酸酯，其分子形式有,游离酸FDPH4与钠盐,如1，6-二磷酸果糖三钠盐（FDPNa3H）等。,FDPNa3H为白色晶形粉末，有旋光，易溶于水，不溶于有机溶剂。,2、生产工艺,1）酶转化工艺,（1）工艺路线：,取经多代发酵应用过的酵母渣，悬浮于适量蒸馏水中，反复,冻融3次,，加入底物（8蔗糖，4NaH,2,PO,4,，30mmolL MgCl,2,，pH6.5）于30，反应6h。,除杂蛋白,煮沸5min,。,阴离子交换柱层析,转酸,FDPCa沉淀,悬浮于水中，732树脂转酸，,NaOH,调pH535.8，除菌过滤后，冻干。,（三）肝素,1、结构与性质,肝素是,天然抗凝剂,，是一种含有,硫酸基,的,酸性粘多糖,。,肝素及其钠盐为白色或灰白色粉末，无臭无味，有吸湿性，,易溶于水,，不溶于,乙醇、丙酮、二氧六环,等有机溶剂，其,游离酸,在乙醚中有一定溶解性。,肝素分子中含有,硫酸基与羧基,，呈,强酸性,，为,聚阴离子，能与阳离子反应成盐,。,硫酸化程度高,的肝素具有较高的,降脂,和,抗凝活性,。小分子量肝素（分子量40005000）具有较低的,抗凝活性和较高,的,抗血栓形成活性,。,2、生产工艺,肝素,系广泛分布于哺乳动物的,肝、肺、心、脾、肾、胸腺、肠粘膜、肌肉和血液,里。,其,生产工艺,主要有,盐解-季胺盐沉淀法,，,盐解-离子交换法,和,酶解-离子交换法,。肝素在组织内和其他,粘多糖,一起与,蛋白质结合成,复合物,，因此肝素制备过程包括,肝素蛋白质复合物的提取,、,解离,和肝素的,分离纯化,两个步骤。,1）盐解-离子交换生产工艺,（1）工艺路线：,继续升温至95，维持10min,。,95乙醇,沉淀过夜,NaOH调PH11，按3量加入H,2,O,2,（,H,2,O,2,浓度30,），,共48小时,。,去热原、杂质,。,3、,检验方法,4、作用与用途,肝素是典型的,抗凝血药,，能阻止血液的凝结过程，用于,防止血栓,的形成。,（四）小分子肝素,1、结构与性质,肝素通过与,AT,结合,并,抑制,a因子和Xa因子活性,而,发挥抗栓、抗凝作用。,（2）工艺过程,降解,。HCl调,pH至2.8,，加,NaNO,2,反应,，反应温度为,1825,，用,KI试纸控制终点,。,还原,。调节,pH至9.8,，反应温度为,1825,，加NaBH,4,反应2h。,沉淀,。调节,pH至5.56.6,，,95乙醇沉淀,，得小分子,肝素粗品,。蒸馏水溶解，,95乙醇沉淀,。蒸馏水溶解，,95乙醇沉淀,。得,小分子肝素精品,。,3、检验方法,抗Xa因子活性测定,抗II a因子活性测定,4、作用和用途,小分子量肝素钠具有,抗,Xa,因子活性,，药效学研究表明小分子量肝素钠对,体内、外血栓,，动静脉,血栓,的形成有,抑制作用,。,（五）香菇多糖,1、结构与性质,香菇多糖系从担子菌纲伞菌科真菌香菇子实体中提取分离纯化获得的均一组分的多糖，香菇多糖是以,（l3）葡萄糖为主链,，,（16）葡萄糖为侧链,的葡聚糖。,重复结构单位一般含有7个葡萄糖残基，其中2个残基在侧链上,。,香菇多糖为白色粉末。香菇多糖的,抗肿瘤作用,与其化学结构尤其是,D（13）链关系密切,。,采用凝胶过滤法（HPLC）和,激光拉曼散射法测得,其相对分子量为4,10,5,8,10,5,。,4、作用与用途,香菇多糖具有广泛的药理学活性，如,免疫调节作用,，,抗肿瘤、抗衰老作用,。目前香菇多糖主要用于,恶性肿瘤的辅助治疗,。,