高效液相色谱法同时测定化妆品中9种香豆素类禁用组分.pdf

第37 卷第6 期2023年11月天津化工Tianjin Chemical IndustryVol.37No.6Nov.2023高效液相色谱法同时测定化妆品中9种香豆素类禁用组分黎莉莉1,郭榕鹏,李永斌1（1.云浮市食品药品检验所，广东云浮52 7 30 0；2.广东药科大学云浮校区，广东云浮52 7 30 0）摘要：目的：建立高效液相色谱法同时测定化妆品中9种香豆素类禁用组分的方法。方法：样品经甲醇超声提取2 0 min，提取液以12 0 0 0 r/min的转速离心5min处理后，采用AgilentZorbaxSB-C18（4.6 x 2 50 mm,5m）色谱柱分离，以乙睛-水为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，柱温为30，采用Agilent1260IIinfinity高效液相色谱仪配二极管阵列检测器在2 47 nm和2 7 5nm波长下检测。结果：9种香豆素类禁用组分的线性范围均为0.2 2 0.0 g/mL,相关系数均大于0.999,平均提取回收率为8 1.913%113.498%，平均方法回收率为98.8 8 0%10 1.47 2%，日内精密度与日间精密度均小于10%。结论：该方法准确、简便，适用于快速同时测定化妆品中9种香豆素类禁用组分。关键词：高效液相色谱法；化妆品；香豆素；禁用组分doi:10.3969/j.issn.1008-1267.2023.06.006中图分类号：TQ658文献标志码：A文章编号:10 0 8-12 6 7(2 0 2 3)0 6-0 0 16-0 6香豆素又名香豆内脂，母核为邻羟基桂皮酸内酯，是一种具有-吡喃酮结构的黄酮类成分，可根据结构将香豆素分为简单香豆素类、喃香豆素类、吡喃香豆素类、其他香豆素类-2 ,因其具有类似香草气味的芳香气味3,商家可能会在日用化妆品中加人一定量的香豆素类化合物作为香料，以增强化妆品的香气。但某些香豆素类化合物对人体具有一定光敏毒性,可引起皮肤红斑、老化、色素沉着等不良反应5-7 ,且香豆素类化合物的透皮吸收率很高8,长期使用经皮肤吸收后可诱发肝损伤,甚至皮肤癌19-10 。我国现行的化妆品安全技术规范(2 0 15年版)中规定，将6-甲基香豆素、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、三甲沙林、欧前胡内酯、补骨脂素、异补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮等9种香豆素类化合物列入禁用组分清单，分别以三种高效液相色谱法将6-甲基香豆素、8-甲氧基补骨酯素等4种组分和补骨脂素等4种组分的检验方法进行收载，暂未能实现对9 种香豆素类禁用组分的同时检测。因此,本文拟建立一种高效液相色谱法同时测定化妆品中9种香豆素类禁用组分的方法，用保留时间和紫外光谱图进行定性，标准曲线法进行定量，以期提高化妆品中香豆素类禁用组分的检验检测效率。1实验1.1 仪器与试剂Agilent1260Infinity型高效液相色谱仪配四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器。6-甲基香豆素（99.98%）8-甲氧基补骨脂素(99.62%）5-甲氧基补骨脂素(98.14%）、三甲沙林（99.2 0%）、欧前胡内脂（98.90%）、新补骨脂异黄酮(98.44%)和补骨脂二氢黄酮(99.36%）均购于Stanford Analytical Chemicals 公司；补骨脂素(99.60%）和异补骨脂素（10 0.0%）均购于中国食品药品检定研究院；乙腈、甲醇和色谱纯均购于默克化工技术（上海）有限公司；一级超纯水由实收稿日期：2 0 2 3-0 8-30作者简介：黎莉莉（1992-），女，主管药师，硕士，主要从事药品和化妆品检验分析的研究。第37 卷第6 期验室自制。1.2色谱条件色谱柱:Agilent Zorbax SB-Cis(4.6x250 mm,5m);流动相是乙腈(A)和水(B);梯度洗脱程序为:0 33min时,2 7%2 7%A;3360min时,2 7%100%A;6070 min 时,10 0%10 0%A;流速为1.0mL/min;进样量为10 L;柱温为30;检测波长为2 47 nm（8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、三甲沙林、欧前胡内脂、补骨脂素、异补骨脂素和新补骨脂异黄酮)和2 7 5 nm(6-甲基香豆素、补骨脂二氢黄酮）。1.3标准溶液的配制分别准确称取9种香豆素类化合物标准品各10.0 mg于2 0 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，分别配制成质量体积浓度为50 0g/mL的标准储备液后于4保存，一周内使用；分别精密量取9 种标准储备液各4mL于50 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，配制成质量体积浓度为40 g/mL的混合标准溶液，临用现配；精密量取质量体积浓度为40 g/mL的混合标准溶液2 5mL于2 0 0 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，摇匀，配制成质量体积浓度为5g/mL的混合标准溶液，临用现配。1.4样品前处理称取样品1.0 g置于10 mL具塞比色管中，加6 mL甲醇涡旋震荡1min后,充分混匀，超声提取2 0 min,冷却至室温,加甲醇定容至刻度,摇匀后转移至10 mL具塞塑料离心管中，以12 0 0 0r/min的转速离心5min，上清液经0.45m滤膜过滤后的滤液作为待测溶液。2实实验结果与讨论2.1色谱条件的优化2.1.1色谱柱的选择不同品牌的色谱柱对化合物的分离表现出一定的差异性。本实验分别考察了同一规格（4.6 x250mm,5m）不同品牌Cis色谱柱（AgilentZor-黎莉莉等：高效液相色谱法同时测定化妆品中9种香豆素类禁用组分-水作为本实验的洗脱系统。2.1.4柱温的选择一般而言，柱温升高能使流动相的黏度下降,化合物出峰时间提前。因此,在不影响化合物性质的前提下,升高柱温可缩短分析时间。本实验设定2 5、30、35、40、45、50 的柱温考察对9种17bax SB-Cis、SH IMA D U Sh i m-p a c k C i s、C A PC E LLPAK MG I S-5 Cis、Ph e n o m e n o x Lu n a C i s、T h e r m oScientific BDS-Cis JADE-PAK ODS-AQ Cis)的分离效果。综合考虑分离度、色谱峰峰型、峰理论塔板数及峰响应值后，选择AgilentZorbaxSB-Cis作为本实验用色谱柱。2.1.2检测波长的选择分别将9 种香豆素类化合物质量体积浓度为50 0 g/mL的标准储备液制成质量体积浓度为5 g/mL 的标准溶液,经二极管阵列检测器在 2 0 0 400nm处进行全波长扫描后可得，补骨脂素、6-甲基香豆素、异补骨脂素、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、三甲沙林、欧前胡内酯的最大吸收波长分别为2 46、2 7 8、2 48、2 48、2 50 2 50、2 7 6、2 50、2 48 nm。综合考虑9种香豆素类化合物的紫外光谱特性，并参考化妆品安全技术规范2 0 15年版)中的规定,本实验确定采用2 47 nm和2 7 5nm作为检测波长,带宽为 4 nm。2.1.3流动相的选择流动相的组成会影响峰型及峰分离度，从而影响色谱峰的分离效果。分别采用甲醇-乙-水、乙腈-0.1%乙酸水、乙腈-磷酸二氢钠（pH值=3.5）、乙腈-磷酸二氢钠(pH值=5.5）、甲醇-水、乙腈-水的流动相体系，比较不同比例流动相组合的效果。结果表明，乙腈的洗脱能力比甲醇更强,出峰时间更短，峰分离效果更好。此外,流动相的pH值对9种香豆素类化合物的分离影响较大，pH值降得越低，峰拖尾现象越严重，峰分离效果越差。经实验对洗脱程序的方法优化，确定采用乙18香豆素类化合物峰分离度的影响。实验表明，温度的升高对6-甲基香豆素峰和异补骨脂素峰的分离影响较大，随着柱温上升，两者之间的峰分离度越小，分离效果越差。经过实验条件的优化，确定柱温为30。2.2枝标准溶液的稳定性考察2.2.1热稳定性考察取质量体积浓度为5.0 g/mL的混合标准溶液各50 mL于50 mL容量瓶中,分别置于40、6 0、80水浴加热30 min，再按本实验的色谱条件方法进行测定。结果显示，9种香豆素类化合物的峰面积随着加热温度的升高而不断增大,同时色谱图中未见其他新增杂质峰，这种情况可能是因甲醇挥发而导致峰面积增大，由此可知,9种香豆素类化合物在高温下未发生降解，热稳定性良好。DAD1A,Sig=247,4Ref=off605040302010天津化工2.2.2光照稳定性考察取质量体积浓度为5.0 g/mL的混合标准溶液各50 mL于10 0 mL烧杯中，分别置于2 54nm的紫外光下照射1、2、6、12、2 4h，再按本实验的色谱条件方法进行测定。结果显示，随着时间的延长，9种香豆素类化合物的峰面积不断增大，同时色谱图中未见其他新增杂质峰，考虑可能是因甲醇挥发而导致峰面积增大，由此可知,9种香豆素类化合物在2 54nm紫外光照射下未发生降解，光照稳定性良好。2.3线性范围、检出限与定量限将质量体积浓度为40 g/mL的混合标准溶液逐级稀释得到质量体积浓度为0.2、0.5、1.0、5.0、10.020.0g/mL的混合标准系列工作溶液后，依次进行测定。由图1可知,所得结果以色谱峰面积由-82023年11月-10时间/min(a)时间/min(b)0246810121416182022242628303234363840424446485052545658606264666870DAD1B,Sig=275,4Ref=off6050403020100-100246810121416182022242628303234363840424446485052545658606264666870图12 47 nm(a)与2 7 5nm(b）波长下的5.0 g/mL混合标准溶液图谱深互星由-9八第37 卷第6 期y对相应的质量体积浓度x(g/mL)绘制标准曲线，以仪器噪声（S/N）与最小检测质量体积浓度(0.2g/mL)计算检出限(LOD)与定量限(LOQ),结果如组分6-甲基香豆素8-甲氧基补骨脂素5-甲氧基补骨脂素三甲沙林欧前胡内酯补骨脂素异补骨脂素新补骨脂异黄酮补骨脂二氢黄酮2.4#提取回收率与方法回收率分别在空白样品中添加40.0 g/mL的混合标准溶液，配制成低质量体积浓度(0.5g/mL)、中质量体积浓度(5.0 g/mL)、高质量体积浓度(2 0.0 g/mL)的加标样品，每个质量体积浓度设置6 个平行样，按照样品前处理方法进行提取，依据本实验方法进行测定，计算提取回收率与相对标准偏差表2 不同加标质量体积浓度下9种香豆素类禁用组分的平均提取回收率及方法回收率组分加标浓度/g/mL）6-甲基香豆素0.5215.20920.8268-甲氧基补骨脂素0.5595.58922.3555-甲氧基补骨脂素0.5445.43721.748三甲沙林0.5505.49621.983欧前胡内酯0.5425.42021.679补骨脂素0.5265.25921.036异补骨脂素0.5765.76023.04新补骨脂异黄酮0.5265.25721.027补骨脂二氢黄酮0.5405.39521.581黎莉莉等：高效液相色谱法同时测定化妆品中9种香豆素类禁用组分表19种香豆素类禁用组分的标准曲线、相关系数、LOD及LOQ标准曲线y=29.107x1.844y=51.669x-12.484y=43.547x-1.514y=63.585x-9.243y=37.064x5.410y=69.811x-6.956y=67.517x-13.228y=41.861x-5.980y=19.480 x3.015平均提取回收率/%扶提取回收率RSD/%平均方法回收率/%方法回收率RSD/%87.6522.27494.6506.61399.9577.81199.2250.65291.1345.16989.4987.82488.5114.53387.8614.98587.4444.453106.3644.38988.8070.81281.9136.176111.6541.46694.5571.20297.5701.668103.0101.40895.7473.32287.7232.59695.6890.91488.7096.75189.4288.065113.4984.47094.6101.56585.6790.795108.3331.31593.7810.99191.7993.30819表1所示。实验结果表明，9种香豆素类禁用组分的标准曲线的相关系数均大于0.999，线性范围良好。相关系数0.99930.99910.99940.99930.99920.99980.99940.99930.9993(RSD)值；样品经前处理提取完成后，分别添加质量体积浓度为40.0 g/mL的混合标准溶液配制成低、中、高质量体积浓度的加标样品，每个质量体积浓度设置6 个平行样,按照本实验方法进行测定，计算方法回收率与RSD值。结果如表2 所示,9种香豆素类禁用组分的平均提取回收率及平均方法回收率的结果均在8 0%12 0%范围之内，满足日常检验要求。98.880101.107101.47299.791100.364100.806100.88899.70099.764100.242100.676100.453100.861101.26499.93299.08199.899100.24699.71199.977100.773103.644100.976100.927100.18599.89299.569LOD/g0.0730.0480.0240.0090.0140.0290.0300.0120.025LOQ/g0.2440.1580.0820.0290.0460.0970.1000.0410.0821.7893.2591.4222.3332.9102.7671.7382.9192.5981.7913.2721.3351.3571.4002.6891.7311.7721.3290.9452.5312.2313.5931.3981.2821.1032.8831.813202.5日内精密度与日间精密度分别取低质量体积浓度（0.5g/mL）、中质量体积浓度（5.0 g/mL)）高质量体积浓度(2 0.0 g/mL)3种加标样品，于同1d内测定每个质量体积浓度水平各6 次并计算日内精密度，以RSD表示；连续6 d每日测定每个质量体积浓度水平各1次并计算日间精密度,以RSD表示。结果显示,不同质量体积浓度下9种香豆素类禁用组分的日内精密度及日间精密度均小于10%，表明精密度良好。2.6样品的测定2.6.1常规样品的测定DAD1A,Sig-247,4 Ref=off605040天津化工采用本实验建立的色谱条件方法分别对市售的面膜类、牙膏类、普通护肤类、宣称去屑洗发类、防晒类、祛痘/抗粉刺类、祛斑/美白类等不同种类的50 件化妆品进行测定，均未检出含有6-甲基香豆素、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、三甲沙林、欧前胡内酯、补骨脂素、异补骨脂、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮这9种香豆素类禁用成分，该结果与按法定标准化妆品安全技术规范2 0 15年版)中方法2.6(6-甲基香豆素）方法2.7(8-甲氧基补骨酯素等4种组分)和方法2.8(补骨脂素等4种组分)分别检验的结果一致。2023年11 月20100入-10时间/min(a)04610121416182022242628303234363840424446485052545658606264666870DAD1B,Sig=275,4Ref=off6050403020100-100246810121416182022242628303234363840424446485052545658606264666870图2 2 47 nm(a)与2 7 5nm(b)波长下某面膜类化妆品加标样品的色谱图八时间/min(b)第37 卷第6 期2.6.2加标样品的测定为进一步对实验方法的准确性和可靠性进行验证，分别在50 件样品中添加一定量的标准溶液，配制成质量体积浓度为5.0 g/mL的加标样品，并按照本实验建立的色谱条件方法和化妆品安全技术规范（2 0 15年版）中规定的3种方法分别进行样品前处理提取与测定，计算两种检验方法测得的加标回收率与RSD值。结果表明，两种检验方法的回归方程相关系数均大于等于0.9990，且两种方法对加标样品的检测值均能达到化妆品安全技术规范（2 0 15版）和国食药监许2 0 10 455号化妆品中禁用物质和限用物质检测方法验证技术规范对实验结果准确度和精密度的要求。图2 为采用本实验建立的方法测定某面膜类化妆品加标样品的色谱图。3结论本文建立了高效液相色谱法同时测定化妆品安全技术规范（2 0 15年版）规定的化妆品中9种香豆素类禁用组分，研究结果表明，该方法具有操作简便、回收率高、精密度好和灵敏度高等特点，极大提高了检验检测的效率,为不同种类的化妆品中检测6-甲基香豆素、8-甲氧基补骨脂素、5-甲氧基补骨脂素、三甲沙林、欧前胡内酯、黎莉莉等：高效液相色谱法同时测定化妆品中9种香豆素类禁用组分制 香料香精化妆品,2 0 10(5):55-58.10白茹玉,张盼阳,毕亚男,等.补骨脂素和异补胃脂素的急性和相互作用.药物评价研究，2 0 18,41(6):10 6 8-10 7 2.21补骨脂素、异补骨脂、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮这9种香豆素类禁用组分提供了更多依据及科学有效的检测方法，对规范化妆品中香豆素类化合物的使用及保护消费者的健康安全有着积极重要的意义。参考文献：1汪洋,雷艳华,成秉辰.化妆品香豆素类化合物的概述黑龙江医药,2 0 13,(6):98 1-98 2,98 3.2周智明,李静,李海敏.化妆品中植物香豆素的使用情况分析 广东化工,2 0 2 0,47(15):8 3-8 5.3 孟宪双,马强,袁汉成,等.化妆品中致敏原香豆素及其衍生物的高效液相色谱法测定及质谱确证J分析测试学报,2 0 16,35(7):799-804.4席海为.香豆素类化合物检测方法及应用研究D.北京：北京中医药大学,2 0 10.5马会娟,马强,李文涛,等.化妆品中8 种呋喃香豆素的高效液相色谱法检测及质谱确证色谱,2 0 13,31(5):416-42 2.6熊友健,杨玉明,姜松,等.呋香豆素类成分及其药理作用研究进展J.中成药,2 0 10,32(10):17 6 4-17 7 0.7刘国清,李静,许建帼,等.高效液相色谱法测定化妆品中香豆素类化合物刀.日用化学工业,2 0 2 0,50(3):2 0 4-2 0 7,2 12.8享郭鹏杰,林志健,张晓朦,等.香豆素类化合物毒理研究及安全性思考,中国中药杂志,2 0 2 0,45(3):518-52 2.9梅家齐,杨得坡.哺香豆素光化学毒性及其脱敏柑橘精油的研参与绿色行动保护美丽家园