高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法分析奶酪中5种生物胺.pdf

基金项目:浙 江 省 基 础 公 益 研 究 计 划 项 目(编 号:L GN C )作者简介:张慧(),女,浙江科技学院正高级工程师,博士.E m a i l:z h a n g h u i c o m收稿日期:改回日期:D O I:/j s p j x 文章编号 ()高效液相色谱三重四极杆串联质谱法分析奶酪中种生物胺D e t e r m i n a t i o no f k i n d so f b i o g e n i ca m i n e s i nc h e e s e sb yh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y张慧ZHANG H u i曹慧C A O H u i王瑾WANGJ i n肖功年X I A OG o n g n i a n姜侃J I ANGK a n(浙江科技学院生物与化学工程学院,浙江 杭州 ;浙江省产品质量安全科学研究院,浙江 杭州 )(S c h o o l o fB i o l o g i c a la n dC h e m i c a lE n g i n e e r i n g,Z h e J i a n gU n i v e r s i t yo fS c i e n c e&T e c h n o l o g y,H a n g z h o u,Z h e j i a n g ,C h i n a;Z h e j i a n gI n s t i t u t eo fP r o d u c tQ u a l i t ya n dS a f e t yS c i e n c e,H a n g z h o u,Z h e j i a n g ,C h i n a)摘要:目的:为生物胺形成机制的研究和食品安全风险评估提供新的技术思路.方法:建立液相色谱三重四极杆串联质谱同时检测奶酪中酪胺、苯乙胺、色胺、章鱼胺和尸胺的 测定 方 法.采 用 超 声 辅 助 溶 剂 萃 取 生 物 胺,H I L I C色谱柱分离,三重四极杆质谱正离子多反应监测模式进行测定,内标法定量;研究提取溶剂种类、超声时间选择和基质效应对峰面积的影响,进行方法学验证和评估.结果:以甲酸乙腈水溶液为提取溶剂,超声提取 m i n,生物胺无需衍生化处理,以乙酸铵(甲酸调p H值为)乙腈为流动相,H P L C M S/M S直接测定.种生物胺的加标回收率为 ,相对标准偏差为 (n);色胺、苯乙胺、酪胺和章鱼胺的检出限为 g/k g,定量限为g/k g;尸胺的检出限为 g/k g,定量限为 g/k g;在各自线性范围内线性关系良好,相关系数均大于 .对市售奶酪样品进行测定,不同样品中不同的生物胺含量差异较大,含量范围为 g/k g,均在安全范围内.结论:试验所建方法适合奶酪中种生物胺含量的快速检测.关键词:液相色谱三重四极杆串联质谱法;非衍生化;奶酪;生物胺;检测A b s t r a c t:O b j e c t i v e:An e wt e c h n i c a l i d e aw a sp r o v i d e df o rt h es t u d yo f b i o g e n i c a m i n e f o r m a t i o nm e c h a n i s ma n d f o o d s a f e t y r i s ka s s e s s m e n t M e t h o d s:A na n a l y t i c a lm e t h o dw a se s t a b l i s h e df o rd e t e r m i n a t i o n o f t y r a m i n e,p h e n y l e t h y l a m i n e,t r y p t a m i n e,o c t o p a m i n ea n dc a d a v e r i n ei nc h e e s e s w i t h h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e m m a s ss p e c t r o m e t r y(H P L C M S/M S)B i o g e n i c a m i n e s w e r e e x t r a c t e d b y u l t r a s o n i c a s s i s t e ds o l v e n te x t r a c t i o nf r o mc h e e s e s,a n dw e r es e p a r a t e db y H I L I Cc o l u m n,d e t e r m i n e db yp o s i t i v ee l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n(E S I)w i t hm u l t i p l er e a c t i o nm o n i t o r i n g(MRM)m o d e,q u a n t i f i e db yt h ei n t e r n a ls t a n d a r d m e t h o d T h ee f f e c to fe x t r a c t i o ns o l v e n tt y p e,u l t r a s o n i ct i m ea n d m a t r i xe f f e c to nt h ep e a ka r e a w a ss t u d i e d,a n dt h ep e r f o r m a n c eo ft h em e t h o dw a sv a l i d a t e da n de v a l u a t e d R e s u l t s:U s i n gf o r m i ca c i d(a c e t o n i t r i l e/w a t e r)a st h e e x t r a c t i o n s o l v e n t,t h e s a m p l e s w e r e e x t r a c t e d b yu l t r a s o u n df o r m i n Amm o n i u m a c e t a t eo f mm o l/L(p Hv a l u ew a sa d j u s t e d t ob y f o r m i c a c i d)a n da c e t o n i t r i l ew e r eu s e da st h em o b i l ep h a s e,b i o g e n i ca m i n e sw i t h o u td e r i v a t i z a t i o nw e r ed e t e c t e db yH P L C M S/M S T h er e c o v e r i e so fb i o g e n i ca m i n e sw e r e a n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s w e r e a tt h r e es p i k e dl e v e l s T h el i m i to fd e t e c t i o no ft r y p t a m i n e,p h e n y l e t h y l a m i n e,t y r a m i n ea n d o c t o p a m i n e w a s g/k ga n dt h el i m i to fq u a n t i f i c a t i o nw a sg/k g;T h el i m i to fd e t e c t i o no fc a d a v e r i n ew a s g/k ga n dt h el i m i to fq u a n t i f i c a t i o nw a sg/k g T h e l i n e a r r e l a t i o n s h i pw a sg o o d i nt h er e s p e c t i v el i n e a rr a n g e s,a n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a sg r e a t e r t h a n T h em e t h o dw a su s e d f o r t h ed e t e r m i n a t i o no fc o mm e r c i a l l ya v a i l a b l ec h e e s es a m p l e s T h ec o n t e n t so fd i f f e r e n tb i o g e n i ca m i n e s i nd i f f e r e n t s a m p l e sv a r i e dg r e a t l y,r a n g i n g f r o m t o g/k g,w h i c h w a s w i t h i nt h es a f er a n g e C o n c l u s i o n:T h e p r o p o s e d m e t h o d w a s s u i t a b l e f o r f a s td e t e r m i n a t i o no f k i n d so fb i o g e n i ca m i n e s i nc h e e s e K e y w o r d s:h i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e m m a s ss p e c t r o m e t r y;w i t h o u td e r i v a t i z a t i o n;c h e e s e;b i o g e n i ca m i n e s;d e t e r m i n a t i o nF OO D&MA CH I N E R Y第 卷第 期 总第 期|年 月|生物胺是一类含氮低分子量有机胺类化合物,常见的有酪胺、组胺、苯乙胺、尸胺、腐胺、色胺等,在多种食品如鱼、黄酒、火腿、豆瓣酱、干酪等中都有检出,一般认为是由于食品在加工或贮藏等过程中微生物产生的氨基酸脱羧酶对食品中的游离氨基酸进行脱羧基等作用而生成.生物胺的安全性和含量密切相关,适量的生物胺是体内的活性成分,而过量的生物胺则会引发系列过敏反应,如苯乙胺、酪胺和色胺可导致人体血压升高、偏头痛等症状,色胺还会增强其他生物胺的毒性;尸胺可引发恶心、咳嗽、呕吐等问题,还可与亚硝酸盐作用形成亚硝胺.奶酪中的生物胺含量和形成规律一直备受关注,刘蕾等 对 种中国传统干酪中生物胺进行了分析,不同样品中生物胺均有检出,含量为 m g/k g.宋雪梅等 研究了牦牛乳干酪在成熟过程中生物胺的变化趋势和细菌群落的结构情况.这些研究大多采用高效液相色谱的方法进行生物胺的分析研究.当 前,食 品 中 生 物 胺 的 检 测 方 法 有 液 相 色 谱法 、高分辨质谱法、气相色谱质谱法、离子色谱法、薄层色谱法、液相色谱质谱法 等.常见的液相色谱法中,生物胺一般需要衍生化后再进行色谱柱分离和测定,样品前处理复杂、耗时长,并且在探索生物胺形成规律的研究中,存在早期低含量的生物胺无法准确监测的问题.L e e等 采用磺基水杨酸溶液提取米 酒 中的种 生 物胺,经 丹 磺酰 氯衍 生 后UHP L C M S/M S进行分析,定量限为 n g/m L.该法提高了检测的灵敏度,但前处理仍需繁琐的衍生化过程.H u a n g等 采用甲酸溶液提取豆瓣酱中的种生物胺,S P E小柱净化,C 柱分离,UHP L C M S/M S直接检测生物胺;Z h a n g等 采用高氯酸提取水产品中的生物胺,经净化和高氯酸溶液稀释,H S ST 色谱柱分离,H P L C M S/M S直接测定.以上两种研究方法均无需衍生化处理,大大提高了检测效率.但是仍然存在生物胺出峰不稳定,方法重现性差,以及强酸溶液易腐蚀质谱仪等问题.奶酪基质复杂,而适合奶酪中多种生物胺的高效提取、无需衍生化处理和稳定性好的快速检测方法尚未有相关研究.研究拟建立超声辅助溶剂萃取、液相色谱三重四极杆串联质谱技术同时检测奶酪中种常见生物胺的测定方法,旨在为生物胺形成机制的研究和食品安全风险评估提供新的技术思路.材料与方法材料与试剂奶酪样品:随机购自超市和网店;酪胺(T y r a m i n e,T y r;C A S号 )、苯 乙 胺(P h e n y l e t h y l a m i n e,P h e;C A S号 )、尸 胺(C a d a v e r i n e,C a d;C A S号 ):纯度,北京曼哈格生物科技有限公司;色胺(T r y p t a m i n e,T r y;C A S号 )、章 鱼 胺(O c t o p a m i n e,O c t;C A S号 ):纯度,北京曼哈格生物科技有限公司;庚胺内标(H e p t y l a m i n e,H e p;C A S号 ):纯度,阿拉丁试剂(上海)有限公司;乙腈:色谱纯,德国M e r c k公司;甲酸、乙酸铵:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;试验用水为M i l l i Q超纯水.仪器与设备H P L C仪:L C A D型,日本岛津公司;三重四极杆串联质谱仪:Q T R A P型,美国A BS C I E X公司;电子天平:F A 型,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;超纯水仪:M i l l i Q型,美国密理博公司;离心机:P型,德国S I GMR公司.方法仪器条件()色谱条件:采用WA T E R SA t l a n t i sH I L I CS i l i c a色谱柱(mm mm,m)分 离,流 动 相A为mm o l/L乙 酸铵 溶液(p H值 为),B为 乙 腈;进 样 量 L;柱温;梯度洗脱程序见表.()质 谱 条 件:E S I正 离 子 模 式;多 反 应 监 测(MRM);喷雾电压为 V;离子源温度为 ;气帘气(N)为 k P a;雾化气(N)压力为 k P a;辅助加热气(N)为 k P a;在电喷雾正离子模式下对质谱参数进行优化.溶液配制()生物胺和内标标准储备液:准确称取各标准品 m g,用m o l/L盐酸溶剂配制质量浓度为m g/m L表梯度洗脱程序T a b l eG r a d i e n t c o n d i t i o n so f l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y时间/m i n流速/(m Lm i n)流动相体积分数/A乙酸铵B乙腈|V o l ,N o 张慧等:高效液相色谱三重四极杆串联质谱法分析奶酪中种生物胺的生物胺单标储备液.()种生物胺混合标准中间液:准确吸取各单标储备液,用甲酸乙腈溶液配制成质量浓度为m g/L(其中尸胺质量浓度为m g/L)的混合标准溶液,冰箱保存.()标准曲线:准确吸取上述混合标准溶液,采用甲 酸 乙 腈 溶 液 配 制 成 g/L或 g/L系列溶剂标准工作液,分别加入等量内标溶液.以标准品质量浓度为横坐标,以定量离子和内标离子的峰面积比值为纵坐标,绘制各标准曲线.提取溶剂的选择以奶酪样品为基质添加混标,分别采用乙腈、甲酸乙腈溶液、甲酸乙腈水溶液(V乙腈V水)各m L进行提取溶剂的比较研究,选择适合的提取溶剂.超声时间的选择以奶酪样品为基质添加混标,设定超声功率为 W,分别选取超声,m i n时间进行超声时间的研究,选择适合的超声时间.样品处理准确称取g研磨好的奶酪样品于 m L具塞离心管中,加入 L内标标准溶液,加入甲酸乙腈水溶液(V乙腈V水)m L涡旋振荡m i n,超声 m i n,r/m i n离心 m i n,取乙腈水溶液层用 m滤膜过滤,待测.方法学验证选取奶酪样品,分别添加低、中、高个水平的种生物胺混标溶液,按照方法提取,同时设置空白对照试验,计算相对标准偏差和加标回收率.数据处理使用A n a l y s tS o f t w a r e软件进行质谱数据 采 集,M u l t i Q u a n t 软 件 进 行 数 据 分 析,M i c r o s o f tE x c e l进行数据处理.结果与分析色谱和质谱条件的优化色谱 条件 的优 化试 验考 察 了A t l a n t i s TM T(mm mm,m)、A d v a n c e B i o G l y c a n M a p(mm mm,m)、H I L I CS i l i c a(mm mm,m)种不同型号色谱柱的分离效果.结果表明,使用反相色谱柱T 柱时种生物胺均未出峰,说明在生物胺T 色谱柱上没有保留;正相色谱柱G l y c a n柱和H I L I C色谱柱上种生物胺均有出峰,但G l y c a n柱峰形较差,而经H I L I C色谱柱分离后生物胺得到较好的保留和峰形.生物胺是一类分子量较低、极性较强的化合物,H I L I C色谱柱的固定相是硅胶,是具有亲水作用的色谱,适合 分 离 亲 水 和 极 性 小 分 子 的 物 质.因 此,选 择H I L I C色谱柱进行生物胺的分离.生物胺还是一类碱性物质,流动相的p H值和组成会对色谱分离和响应强度有较大的影响.崔晓美等 在测定鲣鱼中的生物胺时采用 mm o l/L甲酸铵(p H值为)乙腈为流动相时,生物胺呈现保留并分离.叶磊海等 在检测水产品中的生物胺时采用 mm o l/L甲酸铵(p H值为)乙腈为流动相,兼顾了目标物的保留行为和质谱响应.试验分别采用甲酸乙腈、乙酸铵乙腈作为流动相进行考察,发现mm o l/L乙酸铵(甲酸调p H值为)乙腈为流动相时,种生物胺分离效果和峰形较好,目标物响应值高;而p H值为时,生物胺均有保留但峰的分离度和峰形较差;p H值为时,部分生物胺在色谱柱上没有保留.因此,试验选择mm o l/L乙酸铵(甲酸调p H值为)乙腈作为流动相.种生物胺多反应监测(MRM)色谱图见图.图种生物胺的MRM色谱图F i g u r eMRMc h r o m a t o g r a m so f k i n d so fb i o g e n i ca m i n e s安全与检测S A F E T Y&I N S P E C T I ON总第 期|年 月|质谱条件的优化生物胺的分子中均含有氨基,容易接受质子而形成带正电的分子离子,因此选择在电喷雾正离子模式下进行优化.将 g/L的生物胺单标溶液以针泵注射模式直接进样,通过母离子一级质谱分析得到分子离子峰,以分子离子为母离子进行二级质谱分析,得到子离子信息.进一步优化去簇电压和碰撞能量等参数,结果见表.表生物胺的质谱参数T a b l eM a s ss p e c t r o m e t r i cp a r a m e t e r so fb i o g e n i ca m i n e sa n dh e p t y l a m i n e化合物保留时间/m i n监测离子对(m/z)去簇电压/V碰撞电压/V庚胺(内标)/色胺 /苯乙胺 /酪胺 /章鱼胺 /尸胺 /定量离子.提取溶剂的选择奶酪富含蛋白质等物质,基质较为复杂.一些食品中生物胺的提取溶剂有高氯酸、三氯乙酸、乙腈甲酸铵水溶液 和甲酸乙腈溶液 等,由于酸性较强的溶液容易对质谱或色谱柱造成损伤,因此,选取乙腈、甲酸乙腈溶液和甲酸乙腈水溶液进行奶酪中生物胺的提取研究,结 果 见图.由图可 知,以甲酸乙腈水溶液为提取溶剂时,苯乙胺、酪胺、色胺、章鱼胺和尸胺的峰面积均较高,种提取溶剂的提取图提取溶剂对生物胺色谱峰面积的影响F i g u r eE f f e c t so fe x t r a c t i o ns o l v e n to nt h ec h r o m a t o g r a p h i cp e a ka r e ao fb i o g e n i ca m i n e s效率为甲酸乙腈水溶液甲酸乙腈溶液乙腈.因此,选择甲酸乙腈水溶液为奶酪中生物胺的提取溶剂.超声时间的选择试验考察了超声时间对生物胺提取效果的影响,结果见图.图显示,超声时间为 m i n时随着处理时间 的 延 长,种 生 物 胺 的 提 取 效 率 均 快 速 增 加,而 m i n后峰面积随时间变化趋于平缓,提取效率变化不大.综合考虑,选择超声 m i n作为超声提取时间.图超声时间对生物胺色谱峰面积的影响F i g u r eE f f e c t so fu l t r a s o u n dt i m eo nt h ec h r o m a t o g r a p h i cp e a ka r e ao fb i o g e n i ca m i n e s基质效应奶酪样品的基质较为复杂,采用液相色谱串联质谱分析生物胺时,样品中的复杂成分可能会对生物胺的检测造成干扰,产生基质效应.基质效应可以用样品提取后的空白基质加入待测物的响应与流动相配制的等浓度待测物的响应比值来评价,一般认为响应比值越接近,基质对目标物响应值影响也越小;比值大于,则基质对目标物响应值有增强作用;比值小于,基质对目标物响应值有抑制作用.如表所示种生物胺的响应比值为 ,均远小于,说明奶酪样品基质对生物胺存在较强的离子抑制作用.由于奶酪样品中均含有不同的生物胺,未发现空白基质样品,因此,采用内标法(以庚胺为内标)来减弱或消除基质效应的影响.表奶酪中生物胺的基质效应T a b l eM a t r i xf a c t o r so fb i o g e n i ca m i n e s化合物基质加标的响应值标准品的响应值比值庚胺(内标)色胺 苯乙胺 酪胺 章鱼胺 尸胺|V o l ,N o 张慧等:高效液相色谱三重四极杆串联质谱法分析奶酪中种生物胺线性方程、检出限和定量限配制 质 量 浓 度 梯 度 为,g/L以及质量浓度梯度为,g/L的系列标准混合溶液,以定量离子对峰面积和内标离子对峰面积比值为纵坐标,质量浓度为横坐标,进行标准曲线的绘制.在奶酪基质中添加目标物来考察生物胺检测方法的检出限(等于或大于倍信噪比)和定量限(等于或大于 倍性噪比),具体见表.由表可知,种生物胺线性相关系数(r)为 ,其中色胺、苯乙胺、酪胺 和章 鱼 胺在 g/L范 围 内 线 性 关 系 良 好,检 出 限 为 g/k g,定 量 限 为 g/k g;尸 胺 在 g/L范围内线性关系良好,检出限为 g/k g,定量限为g/k g.刘蕾等 采用丹磺酰氯衍生、液相色谱法检测干酪中种生物胺,生物胺的定量限为 g/m L.Z h a n g等 建 立 了 水 产 品 中 生 物 胺 的HP L C M S/M S检测方法,提取的生物胺未经衍生化处理直接测定,各生物胺的定量限为 m g/k g.试验中种生物胺的定量限为g/k g,方法的灵敏度较高.表生物胺的线性方程、检出限和定量限T a b l eT h e l i n e a re q u a t i o n,L O D sa n dL OQ so fb i o g e n i ca m i n e s化合物线性范围/(gL)线性方程相关系数检出限/(gk g)定量限/(gk g)色胺 Y x 苯乙胺 Y x 酪胺 Y x 章鱼胺 Y x 尸胺 Y x 加标回收与精密度选取合适的奶酪样品分别进行低、中、高个水平的加标回收试验,加标回收率和相对标准偏差结果见表.结果显示:奶酪中种生物胺的平均回收率为 ,相对标准偏差为 (n).方法回收率和精密度良好,满足奶酪样品中种生物胺的分析测定要求.表生物胺的回收率与精密度T a b l eR e c o v e r ya n dR S Do fb i o g e n i ca m i n e s(n)生物胺加标量/(gk g)回收率/相对标准偏差/色胺 苯乙胺 酪胺 章鱼胺 尸胺 实际样品的测定采用所建立的检测方法,对随机购买的市售奶酪棒、再制干酪片、原制奶酪等个样品进行测定.所有样品均有不同的生物胺检出,其中个奶酪棒样品均有酪胺检出,含量最高为 g/k g,色胺和章鱼胺均未检出;个再制干酪片样品中除章鱼胺均未检出外,其他均有检出,最 高 的 为 酪 胺(g/k g),其 次 为 苯 乙 胺(g/k g);个原制奶酪样品中含量最高的也为酪胺(g/k g),其次为苯乙胺(g/k g),章鱼胺均未检出.在所有样品中种生物胺总量最高的是原制奶酪样品号,含量为 g/k g,其次为再制干酪片号,含量为 g/k g.这种生物胺中,酪胺和苯乙胺为检出含量较高的生物胺,对于原制奶酪可能是奶酪成熟过程中由酪氨酸和苯丙氨酸分别通过脱羧基反应转化而来,而再制干酪则通常是以原制奶酪为原料进行加工,由此引入生物胺.一般认为摄入 m g的酪胺或m g的苯乙胺即可引发偏头痛等不良反应,此次个样品中的酪胺和苯乙胺均在安全范围内.杨姗姗等 采用毛细管高效液相色谱从个市售奶酪样品中检出章鱼胺,而此次试验所有样品均未发现章鱼胺.不同的奶酪样品可能由于发酵剂种类、工艺过程或贮存环境等多种因素的影响,其生物胺种类也会有所不同.结论试验建立了液相色谱三重四极杆串联质谱同时检测奶酪中种 生物胺的测定方法,样品以甲酸乙安全与检测S A F E T Y&I N S P E C T I ON总第 期|年 月|表奶酪样品中生物胺含量测定结果T a b l eD e t e r m i n a t i o no fb i o g e n i ca m i n e i nc h e e s es a m p l e(n)g/k g样品色胺苯乙胺酪胺章鱼胺尸胺总量奶酪棒N DN D N DN D 奶酪棒N DN D N D 奶酪棒N D N D 再制干酪片 N D 再制干酪片 N D 原制奶酪N D N D 原制奶酪 N D 原制奶酪 N D N D为未检出.腈水溶液为提取溶剂,经超声提取 m i n,无需衍生化,以mm o l/L乙酸铵(甲酸调p H值为)乙腈作为流动相,采用H I L I C色谱柱分离,正离子多反应监测模式进行测定,内标法消除基质效应并定量.结果表明,种生物胺的回收率为 ,相对 标准 偏 差为 (n),色胺、苯乙胺、酪胺和章鱼胺的检出限为 g/k g,定量限为 g/k g;尸胺的检出限为 g/k g,定 量 限 为 g/k g;相 关 系 数 均 大 于,线性关系良好.采用所建方法对市售奶酪样品进行测定,个 样 品 均 有 不 同 的 生 物 胺 检 出,含 量 范 围 为 g/k g,不同样品中不同的生物胺种类含量差异较大,含量最高的为酪胺(g/k g),其次为苯乙胺(g/k g),均在安全范围内.试验所建方法中样品经提取后无需衍生化,即可对奶酪中种生物胺快速、准确的定性、定量,大幅提高了工作效率,可作为液相色谱方法的补充,为生物胺的形成机制探索和风险评估研究提供新的技术手段.参考文献1 丁海燕,孙晓杰,宁劲松,等.储藏温度对 3 种海水鱼产生生物胺的规律影响研究J.食品科技,2018,43(9):172177.DING H Y,SUN X J,NING J S,et al.Study on the regular ofbiogenicaminesfromthreemarinefishstoredatdifferenttemperature J.Food Science and Technology,2018,43(9):172177.2 宋颖,董全.黄酒中生物胺的形成与控制研究进展J.食品工业科技,2016,37(8):387391.SONG Y,DONG Q.Research progress in formation and control 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