氨基酸组成分析.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第三章 氨基酸组成分析,氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在75,200Da之间，其化学通式为R-CH(NH,2,)-COOH，在生物体,内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生物来源的多肽中出,现D型氨基酸。,氨基酸分析技术的发展始于1820年，由Braconnot最早,将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来，但直到21世纪，用,化学方法或微生物方法测定氨基酸，仍是一项持续数周或数,月的繁琐的工作。,色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。,1941年，Martin等运用色层法分析氨基酸，主要采用乙酰,化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后，Moore、,Stein应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸，在1958年，,Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析,仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段，至今仍是,经典的方法。,第一节 氨基酸组成分析的目的,现代分离提纯技术的发展使蛋白质操作微量化，但也给,定量带来了困难，一般很难通过常规的称量或测蛋白质溶液,在280nm的光吸收值来准确定量蛋白质。所以如果在蛋白,质酶解或测序前，取蛋白质样品的一部分进行氨基酸组成分,析，根据结果便可以推算出蛋白量的可靠值。,另外，在蛋白质测序中有时遇到测不出结果的情况，,一种可能是蛋白质的N端封闭，,另一种可能则是样品本身不是蛋白质或绝大部分是非蛋白质,物质，,解决这个问题的很好途径便是做氨基酸组成分析以确定样品,的成分,。,除了蛋白质研究和重组蛋白需要测定氨基酸组成外，医学,上也需要测定血液或各种体液中的游离氨基酸。,第二节 蛋白质的水解方法,氨基酸分析的第一步是将蛋白质或多肽水解，常规方法是采用,5.7mol/L盐酸在真空状况下于110,水解24h，也有在150,下快速水,解90min。,Waters公司有商品化仪器(水解工作台)出售。将100500,mol的,蛋白质或肽转移到水解指管中冷冻抽干，在水解反应器中加入,5.7mol/L盐酸200,l，含2苯酚(,m,/V)，将指管置于反应器中，抽真,空并充氮气反复三次(图3.1c，真空控制也是实验重复性的一项重要因,素)110保温22h。其中，苯酚是作为一种抗氧化剂来防止半胱氨酸,(Cys)和甲硫氨酸(Met)的氧化。如果遇到一些不易裂解的肽键，如,ValVal，IleLeu等，水解时间可适当延长至72h，但长时间水解会,部分破坏含羟基的氨基酸丝氨酸(Ser)，苏氨酸(Thr)，酪氨酸(Tyr)。,影响氨基酸分析结果的三大因素是：水解、衍生、色谱。,水解是第一步，水解的完全与否对结果影响很大。在实验中,通常采用一些标准蛋白质，如细胞色素c(Cyt c)、核糖核酸,酶(RNase)或胰岛素(insulin)为标样进行水解、衍生和色,谱分析来计算回收，从而考验蛋白质分析的可靠程度和评价,方法的适用性。,但由于各种蛋门质含有的氨基酸多少不同，并且每一种氨,基酸的量也不一样，有的氨基酸含量可多到十几个，有的,氨基酸含量只有12个，这影响到氨基酸的回收。生物应,用公司（ABI）曾设计过一种“测试肽”，即人工合成18种不,同氨基酸的肽(除Gln、Asn外)，这样每种氨基酸出现的频,率都是1，用此肽来校正回收，看来机会均等，是一种可以,采纳的方法，但在实际样品中，不太可能出现这种理想情,况。,(1)还原烷化法,产生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化试剂包括4乙烯,吡啶和碘代乙酸。但这些方法有缺点，为了确保试剂接近巯,基，还原和氧化通常在变性剂存在下进行，多余试剂和变性,剂要用HPLC、沉淀法或透析去除，每一步都可能造成样品的,损失，特别是对于小肽和微量样品，而且烷化反应如果不仔,细控制条件，可能导致半胱氨酸以外其他残基的衍生。,(2)氧化法,氧化反应被用来转化半胱氨酸和胱氨酸成为半胱磺酸，过,甲酸氧化反应的缺点是它会影响其他氨基酸特别是甲硫氨酸,会转变成甲硫氨酸砜，酪氨酸会降解。为克服这一 缺点，必,须准备能分析两次的样品量，一次提供半胱氨酸数据，另一,次则提供其他氨基酸的组成数据。,第四节 氨基酸组成原位分析,如果蛋白质样品采用电泳法(如SDS-PAGE)分离，则很难从凝胶中洗,脱下来，可采用电印迹法把样品转移到PVDF膜上，然后在PVDF膜上直,接进行盐酸水解和氨基酸分析，称之为原位(,in situ,)分析。因为通常,所用聚丙烯酰胺凝胶分离系统中含大量甘氨酸和Tris盐，易干扰氨基酸,原位分析，故改用CAPS缓冲系统以减少影响。另外，在膜上做氨基酸,组成分析时可以做一个空白对照，具体操作时将含蛋白条带的PVDF膜,割下，另取一条相同面积的转移膜作为空白，分别置于水解指管中,加入,70,l含7(,m,/V)巯基乙酸的6mol/L盐酸以防止抽真空时膜片的漂,出，将水解指管放入水解反应器中，在反应器底部加入200,l含7巯基,乙酸的6mol/L盐酸，110真空水解24h，水解结束后用200,l含30,甲醇的0.1mol/L盐酸反复三次将氨基酸从PVDF膜中抽提出来，以便,进行下一步的分析。,第五节 衍生方法及原理,从衍生角度看，氨基酸分析可以分为柱后反应法和柱前衍生法两大,类。前一种方法是将游离氨基酸经过色谱柱分离后，各种氨基酸再与显,色剂(茚三酮、荧光胺、邻苯二甲醛)作用，这种方法比较稳定，对样品,预处理要求低，容易定量和自动化操作，不足之处在于检测灵敏度不高,(100pmol以上)，分析时间长(蛋白质水解液需1h而某些生理样品则需,4h以上)。另一种方法是将氨基酸和化学耦联试剂先反应生成氨基酸的,衍生物，然后再用色谱柱将各种衍生物分离，直接检测衍生物的光吸收,或荧光发射，此法可检测OPA-、PTC、PTH、DABS、Dansyl-,和DABTH-氨基酸，分析灵敏度高，可利用HPLC进行氨基酸分析，缺,点是有的衍生物不稳定，衍生试剂可能干扰氨基酸检测。,以下是几种常见的氨基酸分析方法。,(1)茚三酮法,Spackman等人最早将茚三酮试剂运用到氨基酸组成分,析上。离子交换层析后，各种氨基酸与茚三酮反应形成紫色,化合物，最大光吸收在570nm，摩尔消光系数2X10,4,，茚,三酮和二级胺(脯氨酸和羟脯氨酸)形成黄色产物，在,440nm检出，摩尔消光系数3X10,3,。目前此法的灵敏度可,达100pmol，但茚三酮试剂易氧化，必须隔绝空气避光保,存，试剂本身黏性大，需要有个柱后混合器才能与氨基酸充,分反应，对仪器要求较高。,(2)柱后荧光胺法,20世纪70年代合成了荧光胺，它能在室温下迅速和一级,胺发生反应，其荧光产物的激发波长Ex390nm，发射波长,Em475nm。次级胺可以用N-Chlorosuccinimide(NCS),氧化生成相应的初级胺后再与荧光胺反应而检出。,(3)邻苯二甲醛(OPA)法,OPA最早是被作为柱后衍生试剂而引进的，后来也逐渐应用于柱前反,应中。OPA能在还原剂巯基乙醇存在下和一级胺产生具有很强荧光的异,吲哚衍生物，反应迅速，在室温下1min即可完成，反应络合物的,Ex340360nm，Em455nm，灵敏度比茚三酮法高，在 OPA中加入,SDS或表面活性剂Brij35，不但能提高赖氨酸和羟赖氨酸的稳定性，,而且能提高它们的荧光度。缺点是不能检测次级氨基酸，但可用稀的,Na-hypochlorite在碱性条件下氧化成相应的一级胺，然后再与OPA反,应。,0PA/FMOC作为柱前衍生剂能同时与一级胺和二级胺反应，室温下只,需几分钟，Hewlett Packard公司改用巯基丙酸(3-MPA)引代替巯基乙,醇。由于3-MPA的加入，异吲哚衍生物疏水性降低，使出峰时间提前，,过量的FMOC及其分解产物的出峰时间在最后，被洗脱出的次级氨基酸,之后，不干扰分析结果。,(4)PTC-AA分析法,属柱前衍生法，源于Edman降解法测定蛋白质的一级结,构。异硫氰酸苯酯(PITC)能在碱性条件下和氨基酸反应，,生成PTC-AA，此法分析灵敏度和荧光胺、OPA的荧光法,相同，优点是能同时检出初级和次级氨基酸，在254nm检,出，缺点是操作繁琐，水和盐的副反应敏感，要求较高的操,作技术。,(5)Dansyl-Cl法,能与所有氨基酸柱前反应形成高稳定性的荧光产物，但反,应耗时。,(6)Dabsyl-Cl法,灵敏度是Dansyl-Cl法1/5，但由于反应产生有色衍生,物，能方便地在254nm和425nm处用紫外检测。有报道用,DABITC代替Dabsyl-Cl，反应产生DABTH-AA，在酸性,环境中显红色，易在254nm，269nm和436nm检测。,第七节 结 语,影响氨基酸分析准确性和重复性的因素有三个：,一是样品的水解。水解时间、水解温度、真空度、样品是否被氧化等，都影响实验的结果；,二是氨基酸的有效的衍生情况；,三是氨基酸色层分离好坏。不同样品采用不同的分析方法，,生理样品含有3050种氨基酸，用离子交换色谱柱后衍生,法比较合适，天然氨基酸、合成多肽样品的氨基酸测定多采,用反相色谱柱前衍生分析方法。食品和饲料中氨基酸分析采,用上述两种方法均可。因为反相色谱柱前衍生法具有快速和,灵敏的特点，在药物和手性氨基酸的分析中同样也获得广泛,的应用。,几种氨基酸分析法各有利弊，实验者应根据自己的,实际情况，如精确性、方便性、经济性等来选择合适的方,法。,