细胞培养方法及应用实例.pptx

第二节第二节 细胞培养方法及应用实例细胞培养方法及应用实例一、动物细胞培养方法一、动物细胞培养方法二、植物细胞培养方法二、植物细胞培养方法三、细胞培养反应器三、细胞培养反应器四、细胞工程应用实例四、细胞工程应用实例Cell development method and itCell development method and its applied solid examples applied solid example一、一、动物细胞培养方法动物细胞培养方法 根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培根据动物细胞的生长特点，常见的细胞培养方法有贴壁培养、悬浮培养及固定化培养等三种方法。养及固定化培养等三种方法。1.1.贴壁培养贴壁培养 所谓贴壁培养是指细胞贴附在所谓贴壁培养是指细胞贴附在一定的固相表面（如：培养皿、培一定的固相表面（如：培养皿、培养瓶等）进行的培养。养瓶等）进行的培养。生长特性生长特性 贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴贴壁依赖型细胞在培养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。主要优点主要优点 细胞紧密黏附于固相表面，易更换培养液；易采用灌注培养，从而达细胞紧密黏附于固相表面，易更换培养液；易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统；适用于所有类到提高细胞密度的目的；因细胞固定表面，不需过滤系统；适用于所有类型细胞。型细胞。主要缺点主要缺点 与悬浮培养法相比：扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能与悬浮培养法相比：扩大培养比较困难，投资大；占地面积大；不能有效监测细胞的生长。有效监测细胞的生长。细胞贴壁的表面细胞贴壁的表面 要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷要求具有净阳电荷和高度表面活性。对微载体而言还要求具一定电荷密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。密度；若为有机物表面，必须具有亲水性，并带阳电荷。2.2.悬浮培养悬浮培养 悬浮培养是对非依赖性细胞培养的一种悬浮培养是对非依赖性细胞培养的一种方法。方法。某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择某些贴壁依赖性细胞经过适应和选择也可用此方法培养。也可用此方法培养。悬浮培养投资较小，扩大培养规模简单悬浮培养投资较小，扩大培养规模简单（只须增大培养体积）。如：淋巴细胞的培（只须增大培养体积）。如：淋巴细胞的培养可采用悬浮培养法。养可采用悬浮培养法。细胞悬浮培养瓶细胞悬浮培养瓶进入分裂的静止期。进入分裂的静止期。对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第对于多数悬浮培养物来说，细胞在培养到第181825d 25d 时达到最大的密时达到最大的密度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和度，此时应进行第一次继代培养。在继代培养时，应将较大的细胞团块和接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包接种物残渣除去。若从植物器官或组织开始建立细胞悬浮培养体系，就包括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。括愈伤组织的诱导、继代培养、单细胞分离和悬浮培养。在悬浮培养过程中应注意及时进行细胞在悬浮培养过程中应注意及时进行细胞继代培养，因为当培养物生长到一定时期将继代培养，因为当培养物生长到一定时期将3.3.固定化固定化培养培养 所谓固定化培养是指，将动物细胞与不溶性载体结合起来进行培养的所谓固定化培养是指，将动物细胞与不溶性载体结合起来进行培养的方法。简单地，说就是将被培养生物体固定在一定的培养基上进行培养的方法。简单地，说就是将被培养生物体固定在一定的培养基上进行培养的过程。过程。动物细胞的固定化易于细胞与产物的分离及产品的纯化。因此，固定动物细胞的固定化易于细胞与产物的分离及产品的纯化。因此，固定化是实现动物细胞高密度长期培养、从而提高生物反应器生产效率的重要化是实现动物细胞高密度长期培养、从而提高生物反应器生产效率的重要技术途径。技术途径。常见的固定化方法有：吸附法、共价贴附法、交联法和包埋法等。常见的固定化方法有：吸附法、共价贴附法、交联法和包埋法等。吸附法吸附法 所谓吸附法是指：用固体吸附剂将动物细胞吸附在其表面，从而使细所谓吸附法是指：用固体吸附剂将动物细胞吸附在其表面，从而使细胞固定化。胞固定化。吸附法的主要优点是：操作简便、条件温和；其主要缺点是：载体的吸附法的主要优点是：操作简便、条件温和；其主要缺点是：载体的负荷能力低，细胞易脱落。负荷能力低，细胞易脱落。共价贴附法共价贴附法 所谓共价贴附法是指：利用共价键将动物细胞与固体载体结合的细胞所谓共价贴附法是指：利用共价键将动物细胞与固体载体结合的细胞固定化方法。固定化方法。共价贴附法连接键非常牢固，能有效地减少细胞泄漏；因化学试剂的共价贴附法连接键非常牢固，能有效地减少细胞泄漏；因化学试剂的引入，对细胞的活性有一定的影响。引入，对细胞的活性有一定的影响。交联法交联法 使用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团如氨基、羧基使用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团如氨基、羧基等进行交联，形成共价键来固定细胞，其结合力是共价键。此法制备的细等进行交联，形成共价键来固定细胞，其结合力是共价键。此法制备的细胞与载体结合紧密，但制备麻烦，活力损失较大。胞与载体结合紧密，但制备麻烦，活力损失较大。包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞包埋就是将细胞包裹在有限空间内，制成固定化细胞。包埋后的细胞不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。不会扩散到周围介质中去，而底物和产物却能自由扩散。包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的包埋法仅只是将细胞包埋起来，不与载体发生反应，故包埋法细胞的活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微活性损失较小。包埋法根据其包埋的形式不同，又可将其分为格子型和微胶囊型两种。胶囊型两种。包埋法包埋法二、植物细胞培养方法二、植物细胞培养方法 常常见见的的植植物物组组织织细细胞胞培培养养有有愈愈伤伤组组织织培培养养、原原生生质质体体培培养养、花花粉粉培培养养等方法。等方法。1.1.愈伤组织培养愈伤组织培养 所所谓谓愈愈伤伤组组织织培培养养是是指指，将将外外植植体体接接种种到到人人工工培培养养基基上上，在在激激素素作作用用下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。下，进行愈伤组织诱导、生长和分化的培养过程。植物组织植物组织(消毒消毒)MSMS培养基培养基愈伤组织愈伤组织切取切取接种接种培养培养什么是愈伤组织？什么是愈伤组织？长出茎、叶长出茎、叶生根培养生根培养试管苗试管苗资料卡片资料卡片愈伤组织（愈伤组织（calluscallus）在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下在无菌条件下，将植物器官或组织（如芽、茎尖、根尖或花药）的一部分切下来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成来，放在适当的人工培养基上进行培养，这些器官或组织就会进行细胞分裂，形成新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。新的组织。不过这种组织没有发生分化，只是一团薄壁细胞，叫做愈伤组织。愈伤组织愈伤组织在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便在适合的光照、温度和一定的营养物质与激素等条件下，愈伤组织便开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。开始分化，产生出植物的各种器官和组织，进而发育成一棵完整的植株。在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的愈伤组织，大致要经历三个时期。即：启动期（细胞愈伤组织，大致要经历三个时期。即：启动期（细胞准备进行分裂期）、分裂期和形成期。准备进行分裂期）、分裂期和形成期。2.2.原生质体培养原生质体培养 取取植植株株的的幼幼胚胚、根根、茎茎或或叶叶等等组组织织细细胞胞，用用纤纤维维素素酶酶或或果果胶胶酶酶除除去去植植物物体体细细胞胞的的细细胞胞壁壁（原原生生质质体体），在在培培养养基基上上生生长长分分裂裂，通通过过愈愈伤伤组组织织诱诱导分化长出茎、叶，再长出根形成植株。导分化长出茎、叶，再长出根形成植株。植物细胞植物细胞愈伤组织愈伤组织长出茎、叶长出茎、叶生根培养生根培养驯化移栽驯化移栽原生质体原生质体分离分离破壁破壁接种、培养接种、培养分化培养分化培养生根生根试管苗试管苗3.3.花粉培养花粉培养 在在无无菌菌条条件件下下取取出出花花药药或或花花粉粉粒粒（小小孢孢子子），置置于于培培养养基基上上进进行行人人工工培养，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株。培养，形成花粉胚或花粉愈伤组织，最后形成花粉植株。接种花药接种花药花粉愈伤组织花粉愈伤组织单倍植株单倍植株花粉植株花粉植株三、细胞培养反应器三、细胞培养反应器 细胞培养反应器种类繁多，根据细胞的培养方式不同，可将其分为悬细胞培养反应器种类繁多，根据细胞的培养方式不同，可将其分为悬浮培养反应器、贴壁培养反应器及固定化培养反应设备等。浮培养反应器、贴壁培养反应器及固定化培养反应设备等。1.1.悬浮培养反应器悬浮培养反应器搅拌式反应器搅拌式反应器 常见的悬浮培养反应器如：搅拌式反应器、液体循环式反应器和鼓泡常见的悬浮培养反应器如：搅拌式反应器、液体循环式反应器和鼓泡式反应器等类型，其工作原理与相应的微生物反应器（发酵罐）相同。式反应器等类型，其工作原理与相应的微生物反应器（发酵罐）相同。对于动物细胞，因没有细胞壁的保护，对对于动物细胞，因没有细胞壁的保护，对搅拌剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容搅拌剪切作用十分敏感，直接的机械搅拌很容易对其造成损害。易对其造成损害。同样，植物细胞同样，植物细胞的纤维素细胞壁虽然使细的纤维素细胞壁虽然使细胞具有很强的抗张强度，却使其抗剪切的能力胞具有很强的抗张强度，却使其抗剪切的能力相当弱。因此，相当弱。因此，传统用于微生物的搅拌反应器传统用于微生物的搅拌反应器用作细胞的培养，须对搅拌方式加以改进。用作细胞的培养，须对搅拌方式加以改进。5L 5L 细胞培养罐细胞培养罐 一般情况下搅拌式反应器还常伴有鼓泡，为动物细胞生长提供所需氧一般情况下搅拌式反应器还常伴有鼓泡，为动物细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以须供氧方式上进行改进。分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感，所以须供氧方式上进行改进。笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种，即气泡用丝网隔笼式供氧是搅拌式动物细胞反应器供氧方式的一种，即气泡用丝网隔开，不与细胞直接接触。这样，反应器既能保证混合效果又有尽可能小的开，不与细胞直接接触。这样，反应器既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力，以满足细胞生长的要求。剪切力，以满足细胞生长的要求。供氧方式的改进供氧方式的改进 搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大，这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。例如：采用双螺旋带状搅拌桨，并在顶部法兰盖安例如：采用双螺旋带状搅拌桨，并在顶部法兰盖安装装 3 3块表面挡板。挡板以相对于径向的夹角为块表面挡板。挡板以相对于径向的夹角为3030垂直垂直插入液面。插入液面。由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的由于挡板的存在，可有效地减小反应器内液面上的旋涡。旋涡。搅拌浆的改进搅拌浆的改进 中空纤维反应器因其剪力小被广泛运中空纤维反应器因其剪力小被广泛运用于动物细胞的培养。用于动物细胞的培养。中空纤维反应器主要由中空纤维管组中空纤维反应器主要由中空纤维管组成，中空纤维管的内径为成，中空纤维管的内径为200m200m，壁厚为，壁厚为505070m70m。管壁是多孔膜，。管壁是多孔膜，O O2 2 和和COCO2 2等小等小分子可以自由透过膜扩散，动物细胞贴附分子可以自由透过膜扩散，动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获在中空纤维管外壁生长，可以很方便地获取氧气。取氧气。封闭式中空纤维反应器循环系统封闭式中空纤维反应器循环系统2.2.贴壁培养反应器贴壁培养反应器中空纤维反应器中空纤维反应器 常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反常见的贴壁培养反应器如：中空纤维反应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝应器、玻璃珠床反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器等类型。状反应器等类型。3.3.固定化细胞培养设备固定化细胞培养设备 细细胞胞到到生生长长后后期期，其其生生长长速速度度降降低低，有有利利于于细细胞胞分分化化及及次次级级代代谢谢产产物物积累，则需对其进行固定化培养。积累，则需对其进行固定化培养。固固定定化化培培养养有有利利于于细细胞胞组组织织化化，易易获获得得高高密密度度细细胞胞群群体体，易易于于控控制制培培养条件及获得代谢产物。养条件及获得代谢产物。平床细胞培养系统平床细胞培养系统 平平床床培培养养又又称称为为平平板板培培养养，该该系系统统是是由由培培养床、储液罐和蠕动泵等部件构成。养床、储液罐和蠕动泵等部件构成。平床培养系统示意图平床培养系统示意图蠕动泵蠕动泵培养床培养床进液管进液管储液罐储液罐 将将新新鲜鲜细细胞胞固固定定在在由由聚聚丙丙烯烯材材料料编编织织成成的的无无菌菌平平垫垫（床床）上上，通通过过储储液液罐罐下下方方管管道道滴滴注注培培养养液液。培培养养床床上上的的培培养养液液再再经经过过蠕蠕动动泵泵循循环环送回储液罐中。送回储液罐中。平平床床细细胞胞培培养养系系统统设设备备较较简简单单，比比悬悬浮浮细细胞培养能更有效地合成次级代谢产物。胞培养能更有效地合成次级代谢产物。立柱细胞培养系统立柱细胞培养系统 立立柱柱培培养养系系统统同同样样是是由由培培养养床床、储储液液罐罐和和蠕动泵等部件构成。蠕动泵等部件构成。立柱培养系统示意图立柱培养系统示意图蠕动泵蠕动泵培养床培养床进液管进液管储液罐储液罐 立立柱柱式式细细胞胞培培养养系系统统主主要要用用于于植植物物细细胞胞培培养。养。该该培培养养系系统统是是将将植植物物细细胞胞与与琼琼脂脂或或褐褐藻藻酸酸钠钠混混合合，制制成成2 23cm3cm3 3的的细细胞胞团团块块，并并将将其其集集中中于无菌立柱中。于无菌立柱中。这这样样，由由储储液液罐罐滴滴注注的的培培养养液液流流经经大大部部分分细细胞胞“滴滴液液区区”比比例例与与平平床床培培养养系系统统相相比比，将大大提高。将大大提高。问题思考与讨论问题思考与讨论8 85 5 常见的动物、植物组织细胞培养方法有哪几种？常见的动物、植物组织细胞培养方法有哪几种？8 86 6 什么是细胞的固定化培养？什么是细胞的固定化培养？8 87 7 什么是愈伤组织？什么是愈伤组织？四、动物细胞工程应用实例四、动物细胞工程应用实例 20 20世纪世纪6060年代为了满足生产疫苗的需要，开始运用动物细胞大规模培养年代为了满足生产疫苗的需要，开始运用动物细胞大规模培养技术。后来随着技术。后来随着动物细胞大规模培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发展与动物细胞大规模培养技术的逐渐成熟和转基因技术的发展与应用，人们发现利用动物细胞大规模培养技术生产大分子药用蛋白质比原核应用，人们发现利用动物细胞大规模培养技术生产大分子药用蛋白质比原核细胞表达系统更有优越性。细胞表达系统更有优越性。1.1.甲型甲型H1N1H1N1流感疫苗的生产流感疫苗的生产 甲型甲型H1N1H1N1流感病毒与其它季节性流感病毒与其它季节性流感病毒不同，该病毒毒株包含有猪流感病毒不同，该病毒毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段。的基因片段。人群对甲型人群对甲型H1N1H1N1流感病毒普遍易流感病毒普遍易感，并可以人传染人。感，并可以人传染人。甲型甲型H1N1H1N1流感病毒流感病毒甲型甲型H1N1H1N1流感疫苗的生产流程流感疫苗的生产流程原始种子原始种子（基因重组病毒株）（基因重组病毒株）病毒接种病毒接种增殖培养增殖培养生产用病毒种子生产用病毒种子生产前准备生产前准备病毒接种病毒接种病毒培养病毒培养病毒液病毒液病毒灭活液病毒灭活液病毒灭活病毒灭活病毒纯化液病毒纯化液浓缩纯化浓缩纯化配比配比分包分包疫苗产品疫苗产品病毒培养病毒培养原始种子原始种子基因重组病毒株基因重组病毒株 世卫组织提供的世卫组织提供的6 6支甲支甲型型H1N1H1N1流感原始毒株流感原始毒株 当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细当两种有亲缘关系的不同病毒感染同一宿主细胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于胞时，它们的遗传物质发生交换，结果产生不同于亲代的可遗传的子代，称为基因重组。亲代的可遗传的子代，称为基因重组。基因重组病毒有基因重组病毒有“活病毒基因重组活病毒基因重组”、“灭活灭活病毒基因重组病毒基因重组”及及“死活病毒基因重组死活病毒基因重组”。重组病。重组病毒株原始种子属于死活病毒间的重组。毒株原始种子属于死活病毒间的重组。基因重组病毒株原始种子保留了病毒的抗原性和复制能力，降低了病基因重组病毒株原始种子保留了病毒的抗原性和复制能力，降低了病毒的致病力（由世卫组织提供）。毒的致病力（由世卫组织提供）。因为因为世卫组织提供的基因重组病毒株世卫组织提供的基因重组病毒株量较少，不足以进行批量生产疫量较少，不足以进行批量生产疫苗，必须对其进行扩增培养，制备病毒种子批。苗，必须对其进行扩增培养，制备病毒种子批。例如：将能在鸡胚中生长良好的甲型流感病毒（例如：将能在鸡胚中生长良好的甲型流感病毒（A0A0或或A1A1亚型）疫苗株亚型）疫苗株经紫外线灭活后，再加亚洲甲型（经紫外线灭活后，再加亚洲甲型（A2A2亚型）活流感病毒一同培养，产生出亚型）活流感病毒一同培养，产生出具有前者特点的具有前者特点的A2A2亚型流感病毒，可供制作疫苗。亚型流感病毒，可供制作疫苗。生产前准备生产前准备无菌生产鸡胚无菌生产鸡胚原始种子原始种子（基因重组病毒株）（基因重组病毒株）病毒稀释病毒稀释增殖培养增殖培养生产用病毒种子生产用病毒种子选胚选胚接种接种培养基培养基【选胚选胚】培养生产用病毒种子需要无菌生产培养生产用病毒种子需要无菌生产的的 9 91111日龄鸡胚。日龄鸡胚。要求鸡胚的外壳为白色、整洁，透要求鸡胚的外壳为白色、整洁，透光性好，在暗室光源的照射下，可以清光性好，在暗室光源的照射下，可以清晰地看到鸡胚里的血管等，这样可以很晰地看到鸡胚里的血管等，这样可以很容易剔除弱胚、死胚等。容易剔除弱胚、死胚等。【接种、培养接种、培养】将稀释后的病毒种入选择的鸡胚尿囊将稀释后的病毒种入选择的鸡胚尿囊腔中，随后将鸡胚放入密闭、无菌、恒温腔中，随后将鸡胚放入密闭、无菌、恒温的孵化箱中繁殖病毒。最后从鸡胚尿囊腔的孵化箱中繁殖病毒。最后从鸡胚尿囊腔里中液体中得到疫苗生产用的种子。里中液体中得到疫苗生产用的种子。病毒培养病毒培养原始种子原始种子病毒培养病毒培养生产用病毒种子生产用病毒种子生产前准备生产前准备病毒接种病毒接种（鸡胚）（鸡胚）病毒液病毒液 将得到的生产用病毒种子接种到无菌鸡胚中进行将得到的生产用病毒种子接种到无菌鸡胚中进行培养，得到病毒液。培养，得到病毒液。清洗清洗消毒消毒接种接种病毒灭活病毒灭活灭活试验及灭活试验及其它检验其它检验灭活剂灭活剂(HC(HCH)H)病毒灭活液病毒灭活液 世卫组织提供给疫苗生产厂家世卫组织提供给疫苗生产厂家的毒种尽管感染性很低，但由于仍的毒种尽管感染性很低，但由于仍然是活的病毒，所以还需要对生产然是活的病毒，所以还需要对生产出来的病毒进行灭活处理以去除病出来的病毒进行灭活处理以去除病毒的致病力。毒的致病力。通过往病毒收获液中加入灭活通过往病毒收获液中加入灭活剂（如：甲醛），破坏病毒外壳的剂（如：甲醛），破坏病毒外壳的酯类成分，使其丧失感染正常细胞酯类成分，使其丧失感染正常细胞的能力。的能力。病毒灭活病毒灭活病毒液病毒液病毒收获机病毒收获机 在进入下一工序前，须对病毒灭活液进行在进入下一工序前，须对病毒灭活液进行灭活试验，确保疫苗已经灭活灭活试验，确保疫苗已经灭活得到病毒灭得到病毒灭活液。活液。O O2 2887 710D 10D 病毒灭活液中有很多的杂质，必须加以纯化，以保留病毒作为疫苗的病毒灭活液中有很多的杂质，必须加以纯化，以保留病毒作为疫苗的有效成分有效成分抗原，去除病毒灭活液中的其它杂质，避免这些杂质对人体产抗原，去除病毒灭活液中的其它杂质，避免这些杂质对人体产生不良反应。病毒灭活液的浓缩纯化有多条路线可走。例如：生不良反应。病毒灭活液的浓缩纯化有多条路线可走。例如：浓缩纯化浓缩纯化病毒灭活液病毒灭活液浓缩液浓缩液超滤浓缩超滤浓缩层析层析蔗糖液蔗糖液oror密度梯度密度梯度离心法离心法层析液层析液病毒灭活液病毒灭活液超滤超滤蔗糖蔗糖洗脱洗脱裂解裂解超滤液超滤液裂解剂裂解剂除菌过滤除菌过滤病毒纯化液病毒纯化液配比配比分包分包疫苗产品疫苗产品病毒纯化液检定病毒纯化液检定 抗体是由抗体是由 B B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个泌的。每一个 B B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的动物脾脏有上百万种不同的 B B淋巴细胞系，重排淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的后具有不同基因不同的 B B淋巴细胞合成不同的抗体。淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的激活各个具有不同基因的 B B细胞。被激活的细胞。被激活的 B B细胞分裂增殖形成效应细胞分裂增殖形成效应 B B细细胞（浆细胞）和记忆胞（浆细胞）和记忆 B B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群单克隆。单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。单单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。单克隆抗体是由一种类型的细胞制造出来的抗体。克隆抗体是由一种类型的细胞制造出来的抗体。浆细胞浆细胞2.HBsAg2.HBsAg单克隆抗体的生产单克隆抗体的生产单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体 要制备单克隆抗体，首先需获得能合成专一性抗体的单克隆要制备单克隆抗体，首先需获得能合成专一性抗体的单克隆 B B淋巴细淋巴细胞，但这种胞，但这种 B B淋巴细胞不能在体外生长。淋巴细胞不能在体外生长。单克隆抗体单克隆抗体技术的基本原理技术的基本原理B B细胞细胞HGPRT+HGPRT+HGPRTHGPRT骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞融合融合(HAT)(HAT)培养基培养基HGPRT+HGPRT+HGPRTHGPRT存活的杂交瘤存活的杂交瘤长期体外培养长期体外培养死亡死亡有氨基蝶呤有氨基蝶呤死亡死亡 实验发现骨髓瘤细胞可在体实验发现骨髓瘤细胞可在体外生长繁殖，应用细胞杂交技术外生长繁殖，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞。这种杂种细胞继承两种瘤细胞。这种杂种细胞继承两种亲代细胞的特性，既具有亲代细胞的特性，既具有 B B淋巴淋巴细胞合成专一抗体的特性，又有细胞合成专一抗体的特性，又有骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永骨髓瘤细胞能在体外培养增殖永存的特性，用这种来源于单个融存的特性，用这种来源于单个融合细胞培养增殖的细胞群，可制合细胞培养增殖的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异单克备抗一种抗原决定簇的特异单克隆抗体。隆抗体。HGPRTHGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶HATHAT：次黄嘌呤：次黄嘌呤 氨基蝶呤氨基蝶呤 胸腺嘧啶胸腺嘧啶待融合用骨髓瘤细胞待融合用骨髓瘤细胞（准备）（准备）脾淋巴细胞脾淋巴细胞制备制备HBsAgHBsAg单克隆抗体的生产流程单克隆抗体的生产流程 抗乙型肝炎表面抗原抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(HBsAg)单克隆抗体是专一识别单克隆抗体是专一识别 HBsAgHBsAg的单一抗的单一抗体，能与体，能与HBsAgHBsAg产生免疫反应。运用免疫大鼠脾淋巴细胞与大鼠骨髓瘤的产生免疫反应。运用免疫大鼠脾淋巴细胞与大鼠骨髓瘤的 IR983FIR983F细胞融合技术制造抗细胞融合技术制造抗HBsAgHBsAg单克隆抗体的生产流程如下：单克隆抗体的生产流程如下：健康大鼠健康大鼠(处死处死)饲养细胞饲养细胞制备制备脾脏脾脏大鼠骨髓瘤大鼠骨髓瘤(IR983F(IR983F细胞细胞)细胞融合细胞融合饲养备用饲养备用细胞培养细胞培养浓缩纯化浓缩纯化冻干冻干抗抗HBsAgHBsAg单克隆抗体单克隆抗体（精品）（精品）生产前准备生产前准备【抽取细胞液抽取细胞液】先将大鼠处死，并向其腹腔内注射先将大鼠处死，并向其腹腔内注射10mLDMEM10mLDMEM培养液，轻压腹腔使细胞培养液，轻压腹腔使细胞悬浮，吸出全部细胞悬浮液。悬浮，吸出全部细胞悬浮液。【细胞分离细胞分离】离心分离离心分离5min5min，用，用0.1mol/L0.1mol/L磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（pH=7.4pH=7.4）洗涤，收集细胞。）洗涤，收集细胞。【细胞培养细胞培养】用用1010小牛血清、小牛血清、100U/mL100U/mL青霉素和链霉素、青霉素和链霉素、HATHAT的的DMEMDMEM培养液制成悬培养液制成悬浮，置于浮，置于37 CO37 CO2 2 培养箱中进行温育。培养箱中进行温育。饲养细胞制备饲养细胞制备 在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必在体外的细胞培养中，单个的或数量很少的细胞不易生存与繁殖，必须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞。须加入其它活的细胞才能使其生长繁殖，加入的细胞称之为饲养细胞。因此，制备因此，制备免疫大鼠脾淋巴细胞时应先制备免疫大鼠脾淋巴细胞时应先制备其饲养细胞。饲养细胞的其饲养细胞。饲养细胞的制备工序如下：制备工序如下：抽取细胞液抽取细胞液健康大鼠健康大鼠(处死处死)细胞培养细胞培养饲养细胞饲养细胞(备用备用)细胞分离细胞分离免疫大鼠脾淋巴细胞的制备免疫大鼠脾淋巴细胞的制备健康大鼠健康大鼠(处死处死)洗涤洗涤脾脏脾脏抽取细胞液抽取细胞液离心分离离心分离免疫大鼠脾淋巴细胞免疫大鼠脾淋巴细胞（备用）（备用）细胞悬浮液细胞悬浮液沉淀物沉淀物DMEMDMEM培养液培养液红细胞红细胞磷酸缓冲液磷酸缓冲液【洗涤洗涤】在冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。在冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。【抽取细胞液抽取细胞液】用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用用镊子轻轻挤压脾，做成脾细胞悬液，用毛细管将悬液移入小试管中毛细管将悬液移入小试管中。【离心分离离心分离】直立小试管直立小试管3min3min，使结缔组织下沉；然后将细胞悬液移入离心管中进行，使结缔组织下沉；然后将细胞悬液移入离心管中进行离心分离。离心分离。待融合用大鼠骨髓瘤细胞的准备待融合用大鼠骨髓瘤细胞的准备接种接种(DMEM(DMEM培养液）培养液）培养培养(37(37，15-20h15-20h）大鼠骨髓瘤细胞大鼠骨髓瘤细胞(IR983F(IR983F细胞细胞)制成悬浮液制成悬浮液离心沉淀离心沉淀制成悬浮液制成悬浮液DMEMDMEM培养液培养液待融合用大鼠骨髓瘤细胞待融合用大鼠骨髓瘤细胞(备用备用)亲本亲本 IR983FIR983F细细胞胞一般由有关单位一般由有关单位提供提供 通过融合前的准备工作，得到了通过融合前的准备工作，得到了免疫大鼠脾淋巴细胞和免疫大鼠脾淋巴细胞和待融合用大鼠待融合用大鼠骨髓瘤（亲本）细胞后，可对其进行细胞融合。骨髓瘤（亲本）细胞后，可对其进行细胞融合。免疫大鼠淋巴细胞免疫大鼠淋巴细胞大鼠骨髓瘤细胞大鼠骨髓瘤细胞细胞融合细胞融合融合混合物融合混合物层析层析层析液层析液超滤、浓缩超滤、浓缩浓缩液浓缩液冻干冻干抗抗HBsAgHBsAg单克隆抗体单克隆抗体（精品）（精品）浓缩纯化浓缩纯化杂交细胞混合物杂交细胞混合物细胞培养细胞培养孔板培养孔板培养细胞培养细胞培养融合混合物融合混合物细胞筛选细胞筛选抗抗HBsAgHBsAg单克隆抗体单克隆抗体培养液培养液3.3.迷迭香抗氧化剂的生产迷迭香抗氧化剂的生产迷迭香及其重要成分迷迭香及其重要成分 迷迭香迷迭香(Rosmarinus officinalisRosmarinus officinalis)、被子植物、被子植物门、双子叶植物纲、唇形目、唇形科、迷迭香属灌门、双子叶植物纲、唇形目、唇形科、迷迭香属灌木植物。木植物。迷迭香中含有迷迭香精油及抗氧化剂，其抗氧迷迭香中含有迷迭香精油及抗氧化剂，其抗氧化化成分主要为鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚、熊成分主要为鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酚、熊果酸、迷迭香酸等果酸、迷迭香酸等。Rosmarinus officinalisRosmarinus officinalis迷迭香迷迭香迷迭香精油迷迭香精油（ROSEMARYROSEMARY）迷迭香精油中主要含有迷迭香精油中主要含有蒎烯、蒎烯、1 1，8 8桉桉叶素、莰烯、樟脑、龙脑和叶素、莰烯、樟脑、龙脑和蒎烯等成分。蒎烯等成分。【主要功效主要功效】迷迭香精油具有较强的皮肤收敛作用，调迷迭香精油具有较强的皮肤收敛作用，调理油腻不洁的肌肤，促进血液循环，刺激毛发理油腻不洁的肌肤，促进血液循环，刺激毛发再生；具有强心剂、降血压、调理贫血作用；再生；具有强心剂、降血压、调理贫血作用；具有提神、醒脑、恢复中枢神经活力；具有改具有提神、醒脑、恢复中枢神经活力；具有改善感冒、气喘、慢性支气管炎与流感作用；具善感冒、气喘、慢性支气管炎与流感作用；具有增强消化功能，改善结肠炎、消化不良、胀有增强消化功能，改善结肠炎、消化不良、胀气和胃疼等功效。气和胃疼等功效。迷迭香迷迭香酸（酸（Rosmarinic acidRosmarinic acid）迷迭香酸具有很强的抗氧化性，其抗氧化活力迷迭香酸具有很强的抗氧化性，其抗氧化活力强于维生素强于维生素 E E。迷迭香酸有助于防止自由基造成的。迷迭香酸有助于防止自由基造成的细胞受损，降低癌症和动脉硬化的风险。也被用于细胞受损，降低癌症和动脉硬化的风险。也被用于食品防腐。食品防腐。【主要功效主要功效】抗氧化、延缓衰老；强减肥降脂功效；治疗心抗氧化、延缓衰老；强减肥降脂功效；治疗心血管病及抗癌血管病及抗癌鼠尾草酸（鼠尾草酸（Carnosic acidCarnosic acid）鼠尾草酸具有较强的油溶性成分抗氧化性。在鼠尾草酸具有较强的油溶性成分抗氧化性。在调味酱、宠物食品和饲料中使用，调味酱、宠物食品和饲料中使用，有助于防止自由有助于防止自由基造成的细胞受损，降低癌症和动脉硬化的风险的基造成的细胞受损，降低癌症和动脉硬化的风险的主要。主要。【主要功效主要功效】抗氧化、延缓衰老；强减肥降脂功效；治疗心抗氧化、延缓衰老；强减肥降脂功效；治疗心血管病及抗癌血管病及抗癌迷迭香抗氧化剂提取物迷迭香抗氧化剂提取物迷迭香抗氧化剂的生产流程迷迭香抗氧化剂的生产流程迷迭香迷迭香顶芽顶芽扦插繁殖扦插繁殖移栽移栽油水分离油水分离水蒸气蒸馏水蒸气蒸馏枝叶枝叶馏分馏分减压蒸馏减压蒸馏油层油层迷迭香精油迷迭香精油渣渣晾干晾干粉碎粉碎抗氧化剂抗氧化剂提取原料提取原料过滤液过滤液迷迭香抗氧化剂迷迭香抗氧化剂原料原料浸提浸提9595C C2 2H H5 5OHOH浸提液浸提液过滤过滤减压浓缩减压浓缩回收溶剂回收溶剂悬液悬液水水萃取萃取正丁醇正丁醇减压浓缩减压浓缩有机相有机相回收萃取剂回收萃取剂膏状物膏状物(D1O1(D1O1大孔吸附树脂大孔吸附树脂)柱分离柱分离脱洗脱洗结晶结晶干燥干燥7070C C2 2H H5 5OHOH4.4.紫杉醇的生产紫杉醇的生产紫杉醇紫杉醇 紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物，是目前所了解的惟一一的次生代谢产物，是目前所了解的惟一一种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的种可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。药物。松柏目，红豆杉科，红豆杉属；云南松柏目，红豆杉科，红豆杉属；云南红豆杉是我国红豆杉是我国 4 4种红豆杉之一，高大常绿种红豆杉之一，高大常绿乔木，国家乔木，国家级重点保护野生植物。级重点保护野生植物。小枝叶中含紫杉醇约小枝叶中含紫杉醇约0.010.01，树皮中，树皮中含有紫杉醇（约含有紫杉醇（约0.020.02）、）、三尖杉酯碱等三尖杉酯碱等成分。成分。红豆杉红豆杉 主要功能：抑制真核细胞内蛋白质主要功能：抑制真核细胞内蛋白质的合成，使多聚核糖体解聚，是干扰蛋的合成，使多聚核糖体解聚，是干扰蛋白质合成功能的抗癌药物。白质合成功能的抗癌药物。临床用于治疗急性早幼粒细胞白血临床用于治疗急性早幼粒细胞白血病、急性单核细胞性白血病、急性粒细病、急性单核细胞性白血病、急性粒细胞性白血病及恶性淋巴瘤等。胞性白血病及恶性淋巴瘤等。三尖杉酯碱三尖杉酯碱紫杉醇（紫杉醇（PaclitaxelPaclitaxel）主要功能：对卵巢癌和乳腺主要功能：对卵巢癌和乳腺癌有较好的疗效；对肺癌、大肠癌有较好的疗效；对肺癌、大肠癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴癌、黑色素瘤、头颈部癌、淋巴瘤、脑瘤也都有一定疗效。瘤、脑瘤也都有一定疗效。紫杉醇的生产流程紫杉醇的生产流程（MSMS培养基）培养基）（含紫杉醇（含紫杉醇0.0130.013）红豆杉芽红豆杉芽(外植体外植体)接种接种232325 40D25 40D培养培养（绿色或白色）（绿色或白色）筛选愈伤组织筛选愈伤组织愈伤组织愈伤组织诱导培养诱导培养232325 40D25 40D愈伤组织愈伤组织提取紫杉醇提取紫杉醇问题思考问题思考 铁皮石斛（铁皮石斛（Dendrobium officinaleDendrobium officinale）又名黑）又名黑节草，被子植物门，单子叶植物纲，微子目，气节草，被子植物门，单子叶植物纲，微子目，气生兰科草本植物，主要生于树上和岩石上。生兰科草本植物，主要生于树上和岩石上。石斛有黄草、金钗、马鞭等数十种，其中铁石斛有黄草、金钗、马鞭等数十种，其中铁皮石斛为石斛之极品。皮石斛为石斛之极品。道家医学经典道家医学经典道藏道藏将铁皮石斛列为将铁皮石斛列为“中中华九大仙草华九大仙草”之首。之首。本草纲目本草纲目认为：铁皮石斛具有认为：铁皮石斛具有“强阴益强阴益精，厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，益精，厚肠胃，补内绝不足，平胃气，长肌肉，益智除惊，轻身延年智除惊，轻身延年”等功效。民间称其为等功效。民间称其为“救命救命仙草仙草”。如何应用细胞工程开发铁皮石斛？如何应用细胞工程开发铁皮石斛？铁皮石斛铁皮石斛