精准检验对流式细胞术的发展和质量控制要求.pps

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,精,准检验对,流式细胞术发展,和质量控制需求,盛慧明,2016,年,11,月,11,日,目 录,二、流式细胞术的最新进展,一、流式细胞术发展历史和现状,三、,BEAMing,技术,四、流式细胞术的质量控制,目 录,二、流式细胞术的最新进展,一、流式细胞术发展历史和现状,三、,BEAMing,技术,四、流式细胞术的质量控制,一、流式细胞术发展历史和现状,流式细胞术,Flow Cytometry,现代流式细胞仪产生于上世纪六七十年代，源于对细胞进行分选，所以最早是,Fluorescence-activatedcellsorting,，,FACS,；最早的,omic,经过近四十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经十分成熟并不断推陈出新，广泛运用于从基础研究到临床实践的各个方面,；,是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球，细菌，小型模式生物等）,逐个,进行快速定量分析和分选的技术；,流式细胞术技术平台涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。,流式细胞术完成FCM计数的主要历程,1930年,Casperrsson 和Thorell 开始致力于,细胞的计数,;,1934年,Moldaven 是世界上最早通过,光电仪记录细胞数量,;,1940年,Coons 提出用结合荧光素的,抗体去标记,细胞内的特定蛋白;,1953年,Croslannd Taylor 应用,分层鞘流,原理,奠定了流式细胞术的液流技术基础,;,1956年,Coulter 生产了Coulter,细胞颗粒计数,器,;,1953年,Parker 和Hutcheon 描述一种全血细胞计数器装置,成为流式细胞仪的雏形;,1967年,Holm 等设计了,汞弧光灯激发,荧光染色的细胞，再由光电设备计数的装置;,1973年,Steinkmp设计了利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，达到计数和分选的装置,.,流式细胞术发展历史,流式细胞术完成数据采集和分析技术整合,1965年，Kamentsky开拓性的提出两大设想,：:(1)用分光光度计定量细胞成分;(2)结合测量值对细胞进行分类;,1969年,Van Dilla 和美国的Los Alamos小组研制出液流束、光路轴、检测系统光轴三者相互正交的第一台流式细胞计数器；,1972年,Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型,能够检测出经荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号;,1973年，与Stanford University合作开发世,界上第一台商用流式细胞仪F,ACSI.,Kamentsky,Herzenberg,流式细胞术发展历史,流式细胞仪的基本构造,流式细胞采用的抗体,常用荧光素,：,FITC,激发光,488nm,发射光,525nm,；,PE,激发光,488nm,发射光,575nm;,PE-Cy5,激发光,488nm,发射光,667nm;,PE-Cy7,激发光,488nm,发射光,767nm,。,流式细胞仪是一种任您自由展开想像力的、非凡的检测工具！,TheLSR-Fortessaisa4laser,18colourmachine,By the end of the 1980s,Becton Dickinsons FACScan,One laser,，,three colors,How to align the lasers?,How to compensate the fluorochromes?,流式细胞术的临床应用,HIV免疫分型，CD4,+,绝对计数,淋巴细胞亚群分析（TBNKTreg）,白血病和淋巴瘤的免疫分型,肿瘤的细胞周期和倍体分析,网织红细胞计数,细胞移植的免疫状态监测（Th1/Th2）,干细胞计数（,CD34+,）,阵发性血红蛋白尿,(PNH),HLA-B27,检查（,AS,）,血小板功能及相关疾病,流式细胞术的科研应用,免疫功能研究,细胞周期和倍体分析,细胞凋亡,干细胞研究,树突细胞研究,肿瘤相关基因表达的研究,抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究,放疗/化疗疗效的研究,。,目 录,二、流式细胞术的最新进展,一、流式细胞术发展历史和现状,三、,BEAMing,技术,四、流式细胞术的质量控制,Science.2015 Nov 13;350(6262):739-40.,Anal.Chem.81,68136822(2009).,Curr Protoc Cytom.2013 Jan;CHAPTER:Unit1.27.,J Immunol Methods.2015 August;423:5259.,二、流式细胞术的最新进展,流式细胞术的最新进展,使用超声波（高于,2 MHz,，接近医学影像学所用的声波频率）而非流体动力学聚焦的流式细胞仪，能够沿毛细管中心轴将细胞定位于单一聚焦线上。,Molecules of Equivalent Soluble Fluorochrome,（,MESF,）,DxFLEX,流式细胞术的最新进展,光谱流式细胞术（,Spectral flow cytometry,）,CCD(Charge Coupled Device),是电荷藕合器件图像传感器,光谱流式细胞术,Based on a,spectrograph and multichannel detector(usually CCD,),Vs.mirrors&,optical filters,&,photomultiplier tubes(,PMT.,Rapid multiparameter,collection and,analysis.,质谱流式细胞术（,Mass cytometry,）,电感耦合等离子体质谱,(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry),飞行,质谱流式细胞,(Cytometry by Time-Of-flight,CyTOF),质谱流式细胞术（,Mass cytometry,）,第一、通道数量增加到上百个：,质谱流式细胞仪中的ICP质谱装置具有非常宽的原子量检测范围（88210Da），因此可以同时检测上百个不同的参数。,第二、通道间无干扰，无需计算补偿：,ICP质谱具有超高的分辨能力，可以完全区分开用来标记的各种元素（如右图所示）。这样不仅使实验流程得到简化，也节约了标本和试剂。,第三、金属标签数量多，并具有极低的背景：,目前用来标记抗体的金属标签有30多种，随着技术进步，更多元素可以用来作为标签，其种类会进一步增加。,第四、多样化的数据处理方式，实现对样品的深入分析：,质谱流式细胞仪通道数量的激增带来信息量的成倍增长。传统的流式分析方法已经不能完全满足需要，所以需要对数据进行各种降维处理，提取出其中包含的有用的生物学信息。常用的分析方法有：SPADE、PCA、viSNE以及Gemstone等。,质谱流式细胞术（,Mass cytometry,）,图像流式细胞术（,Imaging flow cytometry,）,Imaging flow cytometry(IFC)platforms combine features of flow cytometry and fluorescent microscopy with advances in data-processing algorithms.,微流控流式细胞术（,Microfluidic,flow cytometry,）,MAGNETIC COUNTING,CR-ACTIVATED SORTING,SORTING BY CELL DEFORMABILITY,RAMAN-ACTIVATED CELL SORTING,These miniaturized labs-on-a-chip enable investigators to enumerate and sort cells based on a wider range of physical and molecular properties than ever before,often without antibodies.,体内流式细胞术（,In vivo,flow cytometry,）,应用能量转化检测声热（,PT,），声光,(PA),荧光，信号整合,大容量检测，对稀有细胞的检测，如,CTC,。,目前主要是动物研究,目 录,二、,流式细胞术的最新进展,一、流式细胞术发展历史和现状,三、,BEAMing,技术,四、,流式细胞术的质量控制,新华社,2016,年,3,月,17,日发布了,中华人民共和国 国民经济和社会发展第十三个五年规划纲要,全文，在第二十三章支持战略性新兴产业发展规划中，生物技术、精准医疗名列其中。,2015,年,1,月,30,日，美国总统奥巴马在国情咨文演讲中宣布了一个新计划,精准医疗计划,(Precision Medicine Initiative),。精准医疗是基于基因差异而进行的个体化治疗。,精准检验,+,精准治疗,=,精准医疗,三、BEAMing技术（数字PCR-流式技术）,1,、,1999,年,Kinzler,和,Vogelstein,提出原始“数字,PCR”,方法,2,、,2003,年,BEAMing,技术：,结合了数字,PCR,以及流式技术，最早是由,Bert Vogelstein,提出。其方法是每一类,DNA,分子都会专一的与磁性珠相连接，然后,DNA,分子之间的差异可以通过流式细胞仪检测荧光标记来做出评估。这种方法是基于小珠,(Bead),、乳浊液,(Emulsion),、扩增,(Amplification),、磁性,(Magnetic),，这四个主要组分来构建的，所以被称作为,BEAMing,。,Jeffrey M.Perkel.The Digital PCR Revolution.Science,11 April 2014;,3.1,基因序列变异的检测,3.2 DNA,甲基化检测,目 录,二、,流式细胞术的最新进展,一、流式细胞术发展历史和现状,三、,BEAMing,技术,四、流式细胞术的质量控制,四、流式细胞术的质量控制,标本,样本采集,抗凝剂使用，放置时间，保存温度,人员,操作差异,解决问题能力,SOP,熟悉度,试剂,不同的批号,荧光信号改变,污染,设备,Different output day to day,不同仪器间,不同实验室间,一、标本的采集和固定方法的质量控制,标本采集是十分重要的,环节,，,需注意：,手术,切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时,，,要避免出血坏死组织,。,标本,采集后要及时固定或深低温保存,，,以免组织发生自溶,，,DNA,降解,，,而造成测试结果的误差,。,固定剂,要采用对组织细胞穿透性强的浓度,。（乙醇浓度,70%,，醇类或者醛类固定剂影响核酸染料的强度，胞内胞外物质固定剂选择）,选择抗凝剂时要注意你要检测的抗原是否受抗凝剂中的组分影响？例如一些,CD41,抗体对,EDTA,非常敏感,裂解液的选择,，某些病理性疾病标本或禽流感标本中有核红细胞可能很难裂解,血浆中是否存在干扰性物质。最典型的例子就是标记,B,细胞表面的免疫球蛋白，由于血浆中的,Ig,会影响抗体结合，所以需要事先用大体积的缓冲液洗涤至少,3,次,全血标本用,Ficoll,密度梯度离心后提取出来的单个核细胞可能会丢失其中某些稀有细胞,二,、,标本处理注意事项,血小板的分析样品制备过程中须防止,过高离心速度,造成血小板膜的损伤,，,出现,血小板凝集,。,待标记的抗原表达部位，如果是分泌出来的分子，还需要加用转运抑制剂（例如,monensin,或,brefeldin A,）。,重视细胞表面抗原同时也有,胞内位点,，如,CD3,、,CD79a/b,。,胞内染色破膜有不同的试剂和方法，两步还是需要的，首先通过固定稳定细胞膜，然后利用去污剂给细胞膜打孔。细胞核内的抗原需要再增加一步破核膜，例如使用甲醇。,染色顺序需考虑先表面染色再胞内染色，同时考虑固定破膜后细胞形态的变化，设置对照管的必要性。,稀有细胞群分析采集数量的要求,。,三,、,细胞悬液荧光染色的质量控制,单细胞悬液样品荧光染色对流式定量分析的精度很重要,，,目前常使用的荧光染料有,EB,、,PI,、,DAPI,、,AO,、,FITC,、,PE,等,，,易受到多种因素的影响,，,以致造成不正确的测定结果,，,的一些常见影响因素需特别注意,：,温度对荧光染色强度的影响,荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例,关系,pH,值对荧光发射强度的影响,其他一些影响荧光强度的因素,对于临床实验尽量选择体外诊断（,IVD,）试剂和分析特异性（,ASR,）试剂，而仅供研究用（,RUO,）试剂一般不能用于体外诊断实验。,四,、,流式大数据计算处理的考虑！,三,、细胞悬液荧光染色的,几种,Control,阴性对照（,Unstained control,）能够体现系统的背景和自发荧光，,同型对照（,Isotype control,）能帮助我们确定染色的非特异性表达，,Fluorescence Minus One(FMO),对照能够帮助我们确定设门的边界。,流式细胞仪的设置和性能跟踪（,CS&T,）,37,重要的几个参数和术语,检测效率,Detector Efficiency,Qr,背景信号,Background Signal,Br,分辨率,Resolution(high signal)%rCV for a bright particle,线性范围,Linear Range,Linearity Min and Max Limits,电子噪音的标准差,Standard Deviation of Electronic Noise,SD,EN,Cytometer 1,APC detector,photoelectrons,Cytometer 2,APC detector,photoelectrons,Low Qr,High Qr,Higher Qr,more sensitivity,检测效率,Detector Efficiency,Qr,Unbound antibody or fluorochrome,Spectral overlap from another marker on a cell,Autofluorescence,Raman scatter,Scatter from the flow cell and ambient light,背景信号,Background SignalBr,Low Br,High Br,Higher Br,less sensitivity.,High QrLow Br,High Qr,High Br,Low Qr,High Br,综合上述,Qr,和,Br,那台流式细胞仪表现最佳？,分辨率,Good Resolution,Poor Resolution,Fluorescence Intensity,影响因素：,激光能量,激光束聚集度和校准,样本流速,X Ab,2X Abs,0,1000,2000,3000,线性度及其影响因素,X Abs,2X Abs,=,1000,2000,重要性：,准确的荧光补偿,定量检测如,DNA,，定量抗原抗体结合,影响因素：,PMT,的质量和匣子,前置放大器和电子元件,激光束及其校准,SD,EN,是电子系统的对检测的信号噪音变异（低,SD,EN,意味着高灵敏度 ）,小的信号检测窗口延滞，对流式检测信号有利！,time,intensity,电子噪音的标准差,time,intensity,threshold,windowextensions,Sensitivity Exercise,intensity,processed,event,time,electronic abort,window extensions overlap,threshold,windowextensions,windowgate,below,threshold,对于一个非生物的荧光微球,，,其,CV,值应越小越好,，,CV,值越小说明仪器准直校正的精度越高,，,一般,CV,值在,2-3.0%,左右,。,对于其他正常二倍体细胞含量的组方图的,CV,值应小于,8%,，,如果大于,8%,，,这个样品应舍掉,，,对于肿瘤细胞样品的,CV,值可以大于,8%,，,这与肿瘤细胞异质性有关,。,对于生物细胞样品本身的生化成分含量的异质性大小,，,固定方法,，,处理程序和荧光染色等都可能造成,CV,值的变化,。,一般认为,，,实测结果,CV,值包括两部分,，,一个,CV,值是使用标准样品测得的仪器,CV,值,，,另一个,CV,值是实验样品所测得的值,，,这个,CV,值,，,是实验样品和仪器,CV,值的总和,流式细胞仪的变异系数,流式的质量控制,室内质量控制,Internal QC,室间质量评估,External QA,人员的培训和资质认证,Training and competency of staff,质量保证链,分析前（,60%,）,分析中,分析后,标本的采集,人员的资质和评价,标本的接收,标本的运送,。,结果报告,记录保存,。,质量控制分析,。,流式专门的组织机构，规范的,SOP,文件,流式细胞术的质控现状,流式应用指导文件和质控,一,.,临床,FCM,应用的质量控制（,12,条建议）,流式细胞仪的校准与性能监测,FCM,临床应用的性能评估,临床,FCM,的全程质量控制,FCM,的工作人员职责和培训,二,.FCM,临床检测项目的应用建议,(28,条建议,),淋巴细胞亚群分析和绝对计数,功能性淋巴细胞亚群分析,CD34,造血干细胞计数,HLA-B27,检测,血液系统恶性肿瘤的免疫分型,急性白血病的微小残留病监测,红细胞分析,DNA,倍体分析,血小板分析,之前,之后,谢 谢,