第十章-色谱技术.ppt

Haga clic para cambiar el estilo de ttulo,Haga clic para modificar el estilo de texto del patrn,Segundo nivel,Tercer nivel,Cuarto nivel,Quinto nivel,*,第十章 色谱技术,目 录,第一节 色谱技术概述,第二节 吸附色谱,第三节 基于疏水作用的高效液相色谱,第四节 体积排阻色谱,第五节 亲和色谱,第六节 离子交换色谱,色谱基本理论、基本概念；生物药品的常用吸附色谱、反相色谱、离子交换色谱以及亲和色谱技术,各种色谱技术中常用的色谱固定相,各类色谱技术的应用领域,针对目标药物体系，熟练选择合适的色谱技术对目标药物进行分离纯化。,学习目标,掌 握,熟 悉,了 解,能力要求,第一节 色谱技术概述,色谱,(Chromatography),技术又被称为层析技术。,一、色谱法分类,固定相基质的形式,分离原理,流动相的形式,纸色谱,薄层色谱,柱色谱,吸附色谱,分配色谱,体积排阻色谱,离子交换色谱,亲和色谱,气相色谱,液相色谱,超临界流体色谱,（一）概述,液相色谱主要通过目标组分或待分离物在两相间分配能力或作用力不同而使目标组分得以分离，其中一相保持不动，称为固定相，而另一相移动，被称为流动相。待分离组分，通过在固定相以及流动相之间各种作用力的矢量和差异而得到分离，这些作用有色散力、氢键、离子键、亲水作用、疏水作用、静电相互作用、分子扩散、亲和、络合、共价键修饰或交换等。,二、基本概念,多孔硅胶,可控孔径玻璃,羟基磷灰石,氧化铝、氧化锆,无机材料,有机高分子,1.,色谱基质,聚苯乙烯,-,二乙烯苯,聚甲基丙烯酸酯,纤维素,葡聚糖及其修饰产物,2,.,粒径和结构,LC,应用,粒径（,m,）,分析型,3,10,制备型,10,40,低压,/,大规模制备型,40,150,极大规模制备型,150,300,中孔填料,大孔填料,微孔填料,3,.,填料孔径,色谱基质的孔径一般必须是待纯化的溶质分子大小的,5,倍以有利于它们通过分子扩散进入所有的孔。,1000,到,10000,180500,60120,4,.,键合相：是,共价键合或通过吸附、涂敷等附着于色谱基质表面上的提供与流动相中溶质分子产生相互作用的分子。,三、色谱效率,（一）基本保留原理,信号强度,t,R,B,t,R,A,半峰宽,W,A,h/2,W,B,h/2,W,A,W,B,基线峰宽,t,o,峰高（,h,）,A,B,0,（样品注射点）,V,o,V,R,A,V,R,B,（死体积）,洗脱体积,/,时间,保留因子或容量因子：,k,=(t,R,-t,o,)/t,o,=(V,R,-V,o,)/V,o,k,越大，则表明该溶质在特定条件下与固定相的作用力越强，对应于保留时间来说，其保留时间较长；反之，则保留时间较短。,选择因子：,=k,B,/k,A,选择因子,越大，则表明,A,和,B,两种成分于特定条件下在该柱子上越容易被分离开来。,柱效：,N=16(t,R,/W),2,=5.54(t,R,/W,h/2,),2,柱子效率越高表明特定条件下固定相对某溶质的分离效果越好。,分辨率：,Rs=(t,R,B-t,R,A)/(W,A,+W,B,),1/2,=(t,R,B-t,R,A)(W,Ah/2,+W,Bh/2,),0.85,=(1/4)(,-1)(N,1/2,)(k,/1+k,),Rs,值越大，两种组分分离的越好。,Rs=1,，两组分具有较好的分离，互相沾染约,2%,，即每种组分的纯度约为,98%,。当,Rs=1.5,时，两组分基本完全分开，每种组分的纯度可达到,99.8%,。,a,b,峰不对称因子,=b/a,10%,峰高,信号强度,洗脱体积,/,时间,峰不对称因子（,As,），主要是反映固定相与组分之间的作用力强弱情况，如果,As,越大，则表明组分与固定相在特定洗脱条件下相互作用力越大，产生拖尾现象。,（二）柱效,柱效：,N=16(t,R,/W),2,=5.54(t,R,/W,h/2,),2,依据塔板理论，塔板数越高，表明溶质分子在柱子上的分离效率越高。,N,已知，柱效可通过柱子的长度（,L,）与理论塔板高度（,H,）之间的比值进行计算，即,N=L/H,。,小粒径色谱填料、低流动相流速和不太粘稠的流动相有利于减小,H,值。,H,值小，则,N,大，此时,W,也小。,（三）样品负载量,样品负载量也称柱容量，是指可以注入色谱系统而又不会使柱过载的最大可进样品量，通常以每克柱填料对应的的最大进样量来表示。,它显示了柱的大小和其对应的样品处理能力，对于分析性色谱来说，样品负载量决定了动态的分析范围。,两种计算方法：,（,1,）以非装柱的形式，通过样品与对应数量的柱填料之间的平衡，确定最大样品负载量；,（,2,）以装柱的形式，在柱色谱中，当进样量达到柱子的饱和负载量时，洗脱液中样品的浓度等于注入样品的浓度。,第二节 吸附色谱,吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择吸附的能力，使其富集在吸附剂表面的过程，被吸附的物质称为吸附质。,四个步骤：,（,1,）吸附剂通入待分离的料液（或气体）；,（,2,）吸附质被吸附到吸附剂表面,（,3,）料液流出,（,4,）吸附质解吸回收，吸附剂再生。,一、吸附类型,（一）物理吸附,分子间引力（范德华力）,特点：,（,1,）无选择性,（,2,）吸附量可由物系不同,相差较大,（,3,）低温可进行,（,4,）单、多分子层吸附均可,（,5,）易达到吸附平衡状态,一、吸附类型,（二）化学吸附,化学键,特点：,（,1,）较高温进行,（,2,）放热,（,3,）单分子吸附,（,4,）不易和解析，平衡慢,（,5,）选择性强,一、吸附类型,（三）交换吸附,双电层,特点：,（,1,）吸附剂和溶液发生离子交换,（,2,）吸附力决定于离子所带电荷,二、常用吸附剂,吸附剂具备特性：,（,1,）对被分离的物质具有很强的吸附能力，即平衡吸附量大；,（,2,）有较高的吸附选择性；,（,3,）有一定的机械强度，再生容易；,（,4,）性能稳定、价廉易得。,（一）、活性炭,活性炭按照粒径大小可分为粉末活性炭、颗粒活性炭以及基于粉末活性炭制备的颗粒型活性炭。,（二）、大孔网状聚合物吸附剂,性质与活性炭、硅胶相似，简称大网格吸附剂、大孔树脂吸附剂或吸附树脂。,（,1,）脱色去臭力与活性炭相当，对有机物质具有良好的选择性,（,2,）性质稳定，机械强度好，经久耐用，品种多,（,3,）吸附速度快，易解吸，易再生，直径在,0.20.8mm,之间，不污染环境，使用方便,（,4,）价格昂贵，吸附效果,易受流速和溶质浓度等因,素影响,1.,大孔网状聚合物吸附剂类型和结构,名称,树脂结构,极性,比表面,孔径,孔度,骨架密度,交联剂,XAD-1,苯乙烯,非极性,100,200,37,1.07,二乙烯苯,XAD-2,330,90,42,1.07,XAD-3,526,44,38,XAD-4,750,50,51,1.08,XAD-5,415,68,43,XAD-6,丙烯酸酯,中极性,63,498,49,双,-,甲基丙烯酸二乙醇酯,XAD-7,-,甲基丙烯酸酯,450,80,55,1.24,XAD-8,-,甲基丙烯酸酯,140,250,52,1.25,XAD-9,亚砜,极性,250,80,45,1.26,XAD-10,丙烯酰胺,极性,69,352,XAD-11,氧化氮类,强极性,170,210,41,1.18,XAD-12,氧化氮类,强极性,25,1300,45,1.17,2.,大孔网状聚合物吸附剂吸附机制,大孔网状聚合物吸附能力与树脂的化学结构、物理性能、溶质及溶液的性质有关。,非极性吸附剂,适宜于从,极性溶剂,（如水）中吸附,非极性物质,。,高极性吸附剂,适宜于从,非极性溶剂,中吸附,极性物质,。,中等极性的吸附剂两种者均可吸附，在非极性溶剂中吸附时，溶质分子以亲水性部分吸着在吸附剂上，而当它在极性溶媒中可同时吸附溶质分子的极性和非极性部分。,解析方法,3,2,4,1,低级醇、酮或其水溶液,碱解析弱酸性溶质,酸解析弱碱性溶质,水洗,其他因素：无机盐、孔径,比表,面积,极 性,颗粒度,孔径,吸附容量大、吸附速度快、机械强度好,三、影响吸附的因素,（一）吸附剂的性质,固体表面张力越小，液体被吸附越多,溶质从较易溶解的溶剂中被吸附时，吸附量较小,同系列物质，吸附量的变化有规律,极性相似，相吸附,预测相对吸附量,（二）吸附质的性质,脱色和除热原一般用活性炭，去过敏物质常用白陶土,。,（三）温度,放热。一旦达到吸附平衡，,温度会使吸附量,。但低温时，,温度,吸附速度,吸附量,吸热。在这种情况下，,温度,吸附量,考虑热稳定性。酶热不稳定，,0,左右吸附；比较稳定，室温操作,普通吸附,蛋白质吸附,生化物质吸附,影响吸附的因素,盐的浓度,溶液,pH,吸附物,浓度与,吸附剂,用量,实验确定,等电点附近吸附量最大。有机酸在酸性下，胺类在碱性下较易为非极性吸附剂所吸附。,吸附质平衡浓度愈大，吸附量愈大；蛋白质、酶分离时，浓度,1%,，以增强选择性；吸附剂用量,第三节 基于疏水作用的高效液相色谱,以疏水作用为基础的液相色谱分离技术主要是反相高效色谱（,RP-HPLC,）和疏水相互作用色谱（,HIC,）。,一、反相高效液相色谱,（一）概述,RP-HPLC,是指固定相具有疏水性功能团构成的表面，在高效分离模式中，流动相的极性一般比固定相强，因此称之为反相高效液相色谱。,应用：分析、分离、脱盐,特点：高分辨率、联用,填料：修饰硅胶、高分子,一、反相高效液相色谱,（二）流动相的选择,1.,反相色谱：,流动相极性大于固定相极性的色谱模式。,常用流动相：甲醇、乙腈等,0,100%,水溶液。根据需要可使用,pH2,pH8,的缓冲液、离子对试剂如,0.1%,的三氟乙酸,流动相选择：相似相溶；,溶质分子疏水性强，增加有机相的比例，更换洗脱能力更强的洗脱剂。,洗脱能力强弱一般为四氢呋喃,乙腈,甲醇,一、反相高效液相色谱,（二）流动相的选择,2.,正相色谱,固定相：未经修饰的硅胶、氧化铝、二氧化锆等，也可以是经过表面修饰后的色谱填料。,采用相对较强的洗脱剂。在正相色谱模式中，一般,很少使用含水溶剂,，在个别情况下，如以硅胶作为固定相时，水可以极微量的形式存在用于饱和硅胶表面上的活性较强的硅羟基位点。,正相色谱流动相可以是石油醚、环己烷、苯、甲苯、乙醇等。,二、疏水相互作用色谱,HIC,主要应用于蛋白质或多肽类的分离中。,HIC,是一种基于蛋白质和固定相非极性区域相互作用的分离过程，,HIC,是,IEC,（离子交换色谱）和,SEC,（体积排阻色谱）的补充，联用,RP-HPLC,可进行进一步分离纯化和脱盐。,HIC,分离蛋白质通常是在中性条件下以线性递减的盐梯度进行洗脱。起始缓冲的盐浓度典型的是在,1.52.0 M,硫酸铵，随着盐浓度的减小，吸附不强的蛋白质首先被洗脱下来。,HIC,可以保持蛋白质或多肽的生物活性而又可有效对其进行分离,HIC,所选用的基质材料通常为硅胶、聚甲基丙烯酸酯、琼脂糖以及其他相关高分子，粒径可以在,5,200,m,范围内选择。,第四节 体积排阻色谱,体积排阻色谱（,SEC,）是将分子按照其大小进行分离的色谱技术，根据固定相和使用环境的不同主要有两种类型，凝胶过滤色谱（,GFC,）和凝胶渗透色谱（,GPC,）。,特点,柱负载量可通过固定相的量来控制，利于制备分离。,严格按分子流体力学体积进行分离,大分子可以测定其分子量和分子量分布,固定相惰性，无需梯度洗脱；柱寿命较长；,固定相生物相容性好，生物大分子活性回收率高,分辨率较低，只适用于分子大小差别较大的体系，其峰容量也较低,一、分离机制,SEC,过程是利用固定相的孔径分布，使分子按照其流体力学体积在固定相的孔及流动相之间不断进行分配而最终分离的。溶剂分子由于相对于固定相的孔径来说通常是非常小的，可以自由出入固定相内各种孔径的孔，而溶质分子一般仅扩散至孔径比自己大的孔中，大于固定相最大可允许进入其孔的大分子，一般只是在构成色谱柱的颗粒之间进行分配。,二、凝胶过滤色谱,凝胶过滤色谱是在水相淋洗体系中，对于水溶性大分子化合物按其分子尺寸大小进行分离的一种液相色谱技术。,应用：水溶性物质尤其是高分子量水溶性化合物的分离。在溶质分子量相差较大的情况下，,GFC,方法是目前最简便的一种分离手段，,GFC,可用于初级分离、缓冲液交换、有机溶剂纯化，用于高分辨和高效快速分离以及分子量的测定等,（一）多糖型,GFC,填料,产品,分离范围,（球蛋白）,粒径,/,m,耐压,/MPa,最高流速,/,cm/h,应用特性,Superdex 75 prep grade,300070000,2244,0.3,90,重组蛋白、细胞色素,Superose 6 prep grade,5000510,6,2240,0.4,40,肽类蛋白、多糖、寡核苷酸、病毒,Sephacyl S-200 HR,5000250000,2575,0.2,60,白蛋白、血液抗体、单抗,Sephacyl S-1000 HR,葡聚糖,510,5,110,8,40105,0.1,300,巨大多糖分子；小颗粒分子如膜结合囊,(7,的溶液中才能正常工作，对酸性更弱的酚羟基树脂，则应的,pH9,的溶液中才能进行反应。,RCOO-Na,+,在水中不稳定，遇水易水解成,RCOO-H,+,，同时产生,NaOH,，故钠型羧酸树脂不易洗涤到中性，一般洗到,pH=99.5,即可，洗水量也不宜过多。,和强酸性阳离子交换性质相反，,H+,和弱酸阳离子树脂的结合力很强，故易再生成氢型，耗酸量亦少。,3.,中强酸性阳离子交换树脂：酸度介于强酸性阳离子交换树脂和弱酸性阳离子交换树脂中间，即含磷酸基团,PO(OH),2,和次磷酸基团,PHO(OH),的树脂。,（二）阴离子交换树脂,1.强碱性阴离子交换树脂,：,活性基是季铵基团，有三甲胺基团（I型）和二甲基-羟基乙基胺基团（II型）。活性基团电离程度较强，不受溶液pH变化的影响，在pH=114范围内均可使用。,成氯型时较羟型稳定、耐热性亦较好，因此，商品大多以氯型出售。I型树脂的热稳定性、抗氧化性、机械强度、使用寿命均好于II型树脂，但再生较难；II型树脂抗有机污染好于I型，II型树脂碱性亦弱于I型。由于OH,-,和强碱交换树脂结合力较弱，再生剂NaOH用量较大。,主要用于制备无盐水（除去SiO2-、CO32-等弱酸根）及卡那霉素、巴龙霉素、新霉素等的精制。,2.,弱碱性阴离子交换树脂,这类树脂的活性基团有伯胺、仲胺和叔胺,以及吡啶等基团。基团的电离程度弱、和弱酸阳离子树脂一样交换能力受溶液,pH,的变化影响很大，,pH,越低，交换能力越高，反之则小，故在,pH7,的溶液中使用。,羟基伯胺型树脂还可进一步与,CHO,发生缩合反应：,和弱酸阳离子树脂相似，弱碱性阴离子交换树脂生成的盐,RN,+,H,3,Cl,-,易水解成,RN,+,H,3,OH,-,，这说明,OH,-,结合力很强，故用,NaOH,再生成羟型较容易，耗碱量亦少，甚至可用,Na,2,CO,3,再生。,3.,中强碱性阴离子交换树脂,中强碱性阴离子交换树脂则兼有以上两类活性基团。,类型,性能,阳离子交换树脂,阴离子交换树脂,强酸性,弱酸性,强碱性,弱碱性,活性基团,磺酸,羧酸,季胺,伯、仲、叔胺,pH,对交换能力的影响,无,酸性溶液中交换能力很小,无,碱性溶液中交换能力很小,盐的稳定性,稳定,洗涤时水解,稳定,洗涤时水解,再生,3,5,倍再生剂,1.5,2,倍再生剂,3,5,倍再生剂,1.5,2,倍再生剂可用碳酸钠或氨水,交换速度,快,慢（除非离子化）,快,慢（除非离子化）,离子交换树脂活性基团的解离程度强弱，即电离常数（,pK,）不同，决定了该树脂的强弱。因此，活性基团的,pK,值能直接表征树脂的强弱程度。对阳离子交换树脂来说，,pK,值愈小，酸性愈强，反之，对阴离子交换树脂来说,pK,值愈大，碱性愈强。,（三）多糖基离子交换剂,多糖基离子交换剂：离子交换纤维素、葡聚糖离子交换剂两类。,1.,离子交换纤维素,离子交换纤维素为开放的长链骨架，大分子物质能自由地在其中扩散和交换，亲水性强，表面积大，易吸附大分子；交换基团稀疏，对大分子的实际交换容量大；吸附力弱，交换和洗脱条件缓和，不易引起变性；分辨力强，能分离复杂的生物大分子混合物。,2.,葡聚糖凝胶离子交换剂,葡聚糖凝胶离子交换剂是将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂。,这类离子交换剂具有离子交换和分子筛的双重作用及对生物分子有很高的分辨率，多用于蛋白质、多肽类生化药物的分离。,离子交换交联葡聚糖有很高的电荷密度，故比离子交换纤维素有更大的总交换容量，但当洗脱介质的,pH,值或离子强度变化时，会引起凝胶体积的较大变化，由此而影响流速。,三、离子交换操作方法,（一）树脂的选择,分离原理：树脂与分离目的物和主要杂质吸附力的差异,当目的物具有较强的碱性和酸性时，宜选用弱酸性弱碱性的树脂。这样有利于提高选择性，并便于洗脱。如目的物是弱酸性或弱碱性的小分子物质时，往往选用强碱、强酸树脂。如氨基酸的分离多用强酸树脂，以保证有足够的结合力，便地分步洗洗脱，对于大多数蛋白质，酶和其他生物大分子的分离多采用弱碱或弱酸性树脂，以减少生物大分子的变性，有利于洗脱，并提高选择性。,含苯酚的磺酸型树脂及胶型阴离子树脂不宜与强碱长时间接触，尤其是在加热的情况下。,（二）树脂的处理和再生,1.,树脂的预处理,物理处理：根据视觉观察是否需要粉碎、过筛及去杂，一般仅需要水洗去杂（如木屑、泥沙）即可，再用酒精或其他溶剂浸泡以去除吸附的少量有机物质。,化学处理：用,810,倍量的,1mol/L,盐酸搅拌浸泡,4h,以上，然后用水反复洗至近中性；再以,810,倍体积的,1mol/L,氢氧化钠溶液搅拌浸泡,4h,以上，反复以水洗至近中性后再用,810,倍体积,1mol/L,盐酸浸泡，最后水洗至中性备用，其中最后一步用酸处理使之变为氢型树脂操作也可称为转型。,2.,树脂的再生、转型和毒化,再生就是让使用过的树脂重新获得使用性能的处理过程。,再生方法：去杂，即用大量水冲洗，以去除树脂表面和孔隙内部物理吸附的各种杂质。然后再用酸、碱处理除去与功能基团结合的杂质，使其恢复原有的静电吸附能力。,转型，即树脂去杂后，为了发挥其交换性能，按照使用要求赋予平衡离子的过程。对于弱酸性树脂须用碱（,NaOH,）或酸（,HCl,）转型。对于强酸或强碱性树脂除使用碱、酸外还可以用相应的盐溶液转型，在稳定性方面，碱性树脂不及酸性树脂，在处理和再生过程中应加以注意。,毒化是指树脂失去交换性能后不能用一般的再生手段重获交换能力的现象。,（三）基本操作方法,1.,离子交换操作的方式,离子交换操作一般分为静态和动态操作两种。静态交换是将树脂与交换溶液混合置一定的容器中搅拌进行。静态法操作简单、设备要求低，是分批进行的，交换不完全，不适宜用作多种成分的分离，树脂有一定损耗。,动态交换是先将树脂装柱，交换溶液以平流方式通过柱床进行交换。该法不须搅拌，交换完全、操作连续，而且可以使吸附与洗脱在柱床的不同部位同时进行，适合于多组分分离。,2.,洗脱,将树脂所吸附的物质释放出来转入溶液的过程称作洗脱。洗脱方式也分静态与动态两种，一般说来，动态交换也称作动态洗脱，静态交换也称作静态洗脱，洗脱液分酸、碱、盐、溶剂等类。,酸、碱洗脱液旨在改变吸附物的电荷或改改变树脂活性基团的解离状态，以消除静电结合力，迫使目的物被释放出来。,盐类洗脱液是通过高浓度的带同种电荷的离子与目的物竞争树脂上的活性基团，并取而代之，使吸附物游离。,实际工作中，静态洗脱可进行一次，也可进行多次反复洗脱，旨在提高目的物收率。动态洗脱在离子交换柱上进行，洗脱液的,pH,值和离子强度可以始终不变，也可按分离的要求人为地分阶段改变,pH,值或离子强度。,3.,再生方式,再生时可以采用顺流再生，即再生液自上向下流动，也可以用逆流再生，即再生液自下而上流动。在逆流再生过程中，再生剂从单元的底部分布器进入，均匀地通过树脂床向上流动。从树脂床的面上通过一个废液收集器而流出，与再生剂向上流动的同时，淋洗的水从喷哂器喷入，经树脂床往下流动，再从下部引出，与再生废液一齐排出。再生剂向上流动与淋洗水向下流动达到一定的平衡状态使树脂床不致向上浮动，需要控制两种溶液的适当流速。,顺流再生,特点：设备简单，操作方便，工作可靠；,再生剂用量多，再生效率低，出水水质较差。,逆流再生,特点：再生剂耗量少,(,比顺流法少,40,左右,),，再生效率高,而且能保证出水质量；,设备较复杂，操作控制较严格。,