第九章--免疫学应用.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第九章 免疫学应用,第一节 免疫学防治,（一）人工自动免疫,给机体输入疫苗或类毒素等抗原物质，刺激机体产生特异性免疫力。免疫力出现较慢但持久，多用于预防。,1,、死疫苗：用物理、化学方法杀死病原微生物制备而成的疫苗。如伤寒、霍乱、百日咳等。,2,、活疫苗：通过毒力变异或人工选择法获得的减毒或无毒株。类似于轻症或隐性感染。如卡介苗、麻疹、风疹、脊灰疫苗。,3,、类毒素：外毒素经,0.3%0.4%,甲醛处理后失去毒性但保持抗原性的生物制品。如白喉、破伤风类毒素。,4,、新型疫苗：亚单位疫苗、合成疫苗和基因工程疫苗。,（二）人工自动免疫的注意事项,1,、接种对象,2,、接种剂量、次数和间隔时间,3,、接种途径,4,、接种后反应,5,、禁忌症,二、免疫学治疗,（一）人工被动免疫,是给机体输入抗体，使机体获得特异性免疫力。维持时间短，一般,23,周，多用于紧急预防。如抗毒素、人丙种球蛋白、人特异性免疫球蛋白。,（二）免疫增强剂,是增强、促进和调节机体免疫功能的生物或非生物制剂。主要用于肿瘤、免疫缺陷病和传染病的辅助治疗。,（三）过继免疫：分特异性和非特异性两种。,（四）免疫抑制剂,抗原-抗体反应的特点,抗原-抗体的结合是特异性结合,抗原抗体结合是分子表面的非 共价键结合,抗原抗体反应可分为两个阶段,特异性结合阶段,可见的反应阶段,抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现,象，于两者的分子比例密切相关,抗原抗体比例对反应现象的影响,抗原-抗体反应受多种因素影响,1,电解质,：抗原-抗体反应通常应用0.85%的氯化钠作为 稀 释液，以供给适应浓度的电解质。,2,温度,：一般常使用反应在37度水浴 或孵育箱中进 行。,3,.,酸碱度,：抗原-抗体反应适应的酸碱度,为,PH68。,抗原-抗体反应受多种因素影响,凝集反应(,Agglutination),细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集 现象，称为凝聚反应。,1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。,2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。,血 球 凝 集,单向免疫扩散(,Single Immunodiffusion),是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的沉淀环，环的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清,IgG、IgM、IgA,和,C,3,等的含量。,含抗体的凝胶,沉淀环,免疫电泳（,Immunoelectrophoresis),是先将待侧血清标本作琼脂凝胶电泳，血清中各蛋白组分被分成不同的区带，然后与电泳方向平行挖一小槽，加入相应的抗血清，把分成区带的蛋白抗原成分作双向免疫扩散，在各区带相应的位置形成沉淀弧。该法常用于血清蛋白种类分析，以观察,Ig,的异常增多或缺失。,火箭电泳,（,Rocket Electrophoresis),火箭电泳也称免疫扩散，是把单向免疫扩散同电泳结合在一起的方法。抗原在含有定量抗体的琼脂中泳动，两者比例适宜时，在较短时间内生成锥形的沉淀峰。在一定浓度范围内，沉淀峰的高度与抗原含量成正比。此法的特点是需时较短，故可用于快速沉淀标本中抗原的含量。,补体结合反应,（,Complement Fixation,CFT),敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。,免疫标记技术,用荧光素、同位素或酶等示踪物质 标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有三种基本类型：免疫荧光技术、免疫酶技术和同位素标记技术。,免疫荧光显微技术(,Immunofluorescence Technique),是用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素，,FITC),与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。,包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。,直接荧光法：将荧光素直接标记抗体作标本染色。该法的优点是特异性强，但其缺点是每检测一种抗原必须制备相应的荧光抗体。,间接荧光法：用一抗与标本中的抗原结合，再用荧光素标记的二抗染色。该法的优点是敏感性比直接法高，制备一种荧光素标记的二抗可用于多种抗原的检测，但非特异性荧光亦会增加。,补体结合免疫荧光法：此法是在间接法的第一步抗原抗体反应时加入补体，使之与抗原抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗,C3,抗体进行示踪。,间接免疫荧光法示意图,流式细胞术,（,Flow Cytometry,FCM),FCM,是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。,FCM,还可对同一细胞的多种参数（如,DNA、RNA、,蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。,流式细胞术,流式细胞仪工作原理,酶免疫测定(,Enzyme Immunoassay,EIA),是用酶（常用的有辣根过氧化物酶，,HRP,和碱性磷酸酶，,AP),标记的抗体进行的抗原抗体反应。,EIA,将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织中或细胞表面的抗原。,ELISA,检测抗体,Ag*Ab Ag,标记抗原 特异性抗体 待测抗原,(Ag*-Ab)+(Ag-Ab),抗原抗体复合物,分离,Ag*-Ab,和游离,Ag*,从标准曲线上读知含量,测定,Ag*-Ab,和/或游离,Ag*,放射性,放射免疫测定法,(,RIA),示意图,RIA,法原理及标准曲线,75,50,30,10,0,1,10,100,1000,未标记抗原浓度（,ng/ml),结合/未结合的放射活性（%）,免疫印迹法(,Immunoblotting),是将凝胶电泳与固相免疫测定结合，先把电泳分区的蛋白质转移到固相载体，再用酶免疫、放射免疫等技术测定。该法能分离分子大小不同的蛋白质并确定其分子量。常用于检测多种病毒 如,HIV,的抗体或抗原。,免 疫 印 迹 法 示 意 图,第二节 淋巴细胞 的测定,检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。外周血是病人主要的检测标本，但仅代表再循环的淋巴细胞。实验动物还可取胸腺、脾、淋巴结等作为标本进行检查。,(1)抗凝,静脉血,(2)加等量,NS,(4)密度梯度离心,血浆,分离液,RBC,PBMC,PMN,(3)混匀后，缓慢加于分离液上,一、淋巴细胞类型和数目的测定,1、花结试验：,E,花结试验可用于检测,T,细胞数目。,EA,花结试验可用于检测,B,细胞数目。,2、免疫荧光法：常采用间接免疫荧光法。,3、流式细胞术：借助流式细胞仪（,FCM)。,花结试验示意图,T,细胞功能测定,体外法 ：,T,细胞增殖试验,形态学检查,3,H-TdR,掺入法,MTT,法,体内法：用生物抗原或化学抗原作皮内试验。,OT-PPD,皮试,SD-SK,皮试,培养液,3,H-TdR,PHA,淋巴细胞,全血,分层液,离心,过滤,测量放射性,淋巴细胞增殖试验（,3,H-TdR,掺入法）示意图,靶细胞,51,Cr,洗涤,去除游离的,51,Cr,效应细胞,测量上清液中释放的,51,Cr,混合培养4-6小时,细胞毒试验（,51,Cr,释放法）示意图,酶联免疫斑点法（,Enzyme-Linked Immunospot,ELISA),是在,ELISA,的基础上建立的检测抗体生成细胞及细胞因子产生细胞的方法。,CK,抗体包被的反应板,CK,抗原包被的反应板,加入淋巴细胞,加入酶标记二抗,加入底物,检测抗原特异性,B,细胞,加入底物,T,细胞产生,CK,的检测,加入淋巴细胞,加入酶标的,CK,抗体,淋巴细胞转化试验（,形态学示意图,）,原理：人,T,细胞表面有,PHA,或,ConA,受体，,T,细胞在体外受,PHA,或,ConA,的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定,T,细胞的功能。,PHA,刺激,4872小时,淋巴细胞增殖,3,H-TdR,掺入法,原理：将单个核细胞中加入,PHA,共同培养，在终止培养前815小时加入氚标记的胸腺嘧啶核苷（,3,H-TdR),经,-,液体闪烁仪检测淋巴细胞,DNA,的,3,H-TdR,掺入量，推测淋巴细胞增殖的程度。,MTT(,四甲基偶氮唑盐）法,原理：在细胞培养终止前数小时加入,MTT，,活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶分解,MTT,产生蓝色甲攒（,Formazan),沉积于细胞内或细胞周围，形成甲攒的量与细胞增殖程度成正相关。,细胞毒试验,CTL,介导的细胞毒试验：常采用,51,Cr,释,放法,NK,细胞的细胞毒试验：常用的靶细胞,为,K562,细胞,