高效液相色谱-电雾式检测器法测定益母草中盐酸水苏碱.pdf

现代食品XIANDAISHIPIN112/分析检测Analysis and Testingdoi:10.16736/41-1434/ts.2023.19.030高效液相色谱-电雾式检测器法 测定益母草中盐酸水苏碱Determination of Stachydrine Hydrochloride in Leonurus japonicus by HPLC-CAD 卢柏林1，马恩耀1,2，周劲松1,2，孙心恒1，谢珊珊1（1.广东汉潮中药科技有限公司，广东 广州 510360；2.广州采芝林药业有限公司，广东 广州 510360）LU Bolin1,MA Enyao1,2,ZHOU Jinsong1,2,SUN Xinheng1,XIE Shanshan1(1.Guangdong Hanchao Traditional Chinese Medicine Technology Co.,Ltd.,Guangzhou 510360,China;2.Guangzhou Caizhilin Pharmaceutical Co.,Ltd.,Guangzhou 510360,China)摘 要：目的：建立分析测定益母草中盐酸水苏碱的方法。方法：通过 70%乙醇回流对益母草中盐酸水苏碱有效成分进行提取，并使用高效液相色谱仪-电雾式检测器直接测定。结果：盐酸水苏碱的线性范围为 0.50 5.01 g（r=0.999 5）；精密度、重复性及稳定性的 RSD 均小于 2.0%；盐酸水苏碱的平均回收率为100.28%（RSD=1.43%）。结论：本方法重复性良好，准确度较高，操作简单便捷，灵敏度较高，可用于益母草中盐酸水苏碱含量的测定。关键词：益母草；盐酸水苏碱；高效液相色谱Abstract：Objective:To establish a method for the determination of stachydrine hydrochloride in Leonurus japonicus.Method:The effective components of hydrostachlorine hydrochloride from Leonurus japonica were extracted by 70%ethanol reflux and directly determined by high performance liquid chromatograph-electric fog detector.Result:The linear range of stachydrine hydrochloride is 0.50 5.01 g(r=0.999 5).Precision,repeatability,and stability RSD are all less than 2.0%;the average recovery rate of stachydrine hydrochloride is 100.28%(RSD=1.43%).Conclusion:The method has good repeatability,high accuracy,simple operation and high sensitivity,which can be applied to determine the content of stachydrine hydrochloride in Leonurus japonicus.Keywords：Leonurus japonicus;stachydrine hydrochloride;high performance liquid chromatography中图分类号：O657.7益母草属于唇形科植物，具有活血消肿、调经利尿、清热解毒等多种功效，常作为治疗月经不调、痛经经闭、恶露不尽、水肿尿少和疮疡肿毒等症状的主治药物1。益母草中的主要化学成分包括生物碱类、基金项目：国家重点研发计划“乡村产业共性关键技术研发与集成应用”重点专项（2022YFD1600300）；广州市荔湾区科技计划项目（202105001）；广州市重点研发计划（SL2022B03J01258）；广州市重点研发计划（202206010165）。作者简介：卢柏林（1996），男，本科，初级中药师，研究方向为中药材的质量检测。通信作者：马恩耀（1991），男，硕士，主管中药师，研究方向为中药物质基础及其质量标准。E-mail：。现代食品XIANDAISHIPIN113/分析检测AnalysisandTesting环烯醚萜类、二萜类、苯丙醇苷类、黄酮类和香豆素类等，同时含有铁、锰、锌、铅等多种微量元素。生物碱类中的益母草碱及盐酸水苏碱属于益母草的重要活性成分2-3，因此是益母草质量控制重点关注的成分。在 2020 年版中国药典中，首次在通则 0512“高效液相色谱法”的高效液相色谱仪检测器中补充了电雾式检测器（Charged Aerosol Detector，CAD）。CAD 是基于雾化-气溶胶的检测器，其检测原理是将液相洗脱液雾化蒸发后检测溶质颗粒的带电粒子的信号流，具有灵敏度高、重复性好、不依赖于化学结构信号响应一致性、动态检测范围宽、操作直观简单的优点，适用于分析各种不挥发或半挥发性化合物4。中药中含有大量糖类及苷类等紫外吸收弱的成分，因此电雾式检测器在中药分析研究中应用越来越广泛5-8。蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）属于通用型检测器，是扩充高效液相色谱检测范围的重要检测器之一。因此，对于类似益母草中盐酸水苏碱等无紫外吸收成分的含量测定，现多采用高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）搭配 ELSD 检测器的方法进行检测。但 ELSD 检测器本身存在线性范围较窄、基线噪音偏大、影响因素较多等缺点。在中国药典益母草项下盐酸水苏碱的测定方法中，供试品中盐酸水苏碱目标峰前容易有干扰峰，分离度较差，需要在要求范围内更改流动相比例或柱温、流速等才能把目标峰与干扰峰分离，从而达到准确定量的效果，但相对会影响效率。因此，本次试验将用 CAD 检测器代替 ELSD 检测器对益母草中盐酸水苏碱进行测定，以准确定量和提高效率。1材料与方法1.1材料与试剂益母草，购于市场。盐酸水苏碱对照品（批号：110712-201916），中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯），CNW；冰醋酸（AR）、乙醇（AR），天津市大茂化学试剂厂；水为超纯水。1.2仪器与设备Thermo Ultimate 3000 高 效 液 相 色 谱 仪（配 备Corona Veo RS CAD 检测器），Chromeleon 7.0 色谱工作站，赛默飞世尔科技（中国）有限公司；水浴锅，常州国宇。1.3方法1.3.1色谱条件色谱柱：Welch Ultimate XB-Diol（250 mm4.6 mm，5 m）；流动相：甲醇 0.2%冰醋酸=80 20；流速：1.0 mLmin-1；柱温：30；进样量：10 L。CAD 检测器条件：雾化温度为 40，数据采集频率为 20 Hz，过滤常数为 1.0 s。1.3.2对照溶液的制备取盐酸水苏碱对照品适量，在精密称定后加入70%乙醇溶液配制成浓度为 0.5 mgmL-1的溶液。1.3.3供试品溶液的制备将益母草磨成粉过三号筛，称取粉末约 1.0 g，在精密称定后置于具塞锥形瓶中，在精密加入 25 mL 的70%乙醇溶液后，称定重量，水浴加热回流 2 h，放冷后再称定重量，用 70%乙醇溶液补足减失的重量，摇匀后过滤，弃去初滤液，取续滤液，即得。1.3.4样品的测定取不同产地批次的益母草，按1.3.3项下方法操作，按1.3.1色谱条件测定，同时也按照2020年版 中国药典一部中益母草项下的盐酸水苏碱测定方法进行测定，并计算盐酸水苏碱的含量，将两者结果进行对比。2结果与分析2.1实验条件优化结果2.1.1检测器的选择在中国药典及多个地方标准当中，益母草中盐酸水苏碱的测定方法多选择高效液相色谱仪搭配蒸发光散射检测器。由于蒸发光散射检测器本身的特殊性，往往在实际操作当中需要提前开启蒸发光稳定较长的时间，而且基线噪音的影响比较明显。因此，本实验选择同为通用检测器的电雾式检测器代替蒸发光散射检测器对盐酸水苏碱进行检测，测定结果与HPLC-ELSD 法基本一致。2.1.2流动相的选择在中国药典中，益母草中盐酸水苏碱的测定方法为 HPLC-ELSD，流动相为乙腈-0.2%冰醋酸；当把相同的流动相用于 HPLC-CAD 时发现，能把供试品中的干扰峰分离，但分离度只能达到 1.04 左右。本实验将流动相改为甲醇-0.2%冰醋酸，供试品中的干扰峰会被提前洗脱，盐酸水苏碱目标峰前后均没有影响结果的干扰峰，并且检测结果与 HPLC-ELSD 基本一致9-10。这说明，以甲醇-0.2%冰醋酸为流动相，现代食品XIANDAISHIPIN114/分析检测Analysis and Testing利用电雾式检测器检测盐酸水苏碱效果较好。2.2色谱图按优化后的 1.3.1 色谱条件测定对照品溶液和供试品溶液，可看出供试品中其他成分对盐酸水苏碱目标峰无干扰。盐酸水苏碱对照品溶液、益母草供试品溶液色谱图见图 1。（a）对照品溶液（b）供试品溶液图 1益母草 HPLC-CAD 色谱图2.3方法学验证2.3.1线性和范围将 1.3.2 对照溶液（实际浓度为 0.501 mgmL-1）依次进样 1 L、2 L、3 L、6 L、8 L 和 10 L 测定各成分的峰面积，以进样量（g）的对数值为横坐标（x），以峰面积的对数值为纵坐标（y），进行线性回归。结果表明，盐酸水苏碱在 0.50 5.01 g 线性良好，回归方程为 y=5.631 2x-0.276 2，r=0.999 5。2.3.2精密度精密吸取对照品溶液，进样 6 L，按 1.3.1 色谱条件测定，连续进样 6 次，结果见表 1。盐酸水苏碱峰面积的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，现代食品XIANDAISHIPIN115/分析检测AnalysisandTestingRSD）为 0.33%，表明仪器精密度满足要求。表 1盐酸水苏碱精密度测定结果表峰面积/（pAmin）RSD/%16.1380.3316.28816.24916.26716.20716.2082.3.3重复性精密称取同一批益母草粉末（过三号筛）6 份（每份约 1 g），按 1.3.3 项下方法操作，制成供试品溶液，按 1.3.1 色谱条件测定，结果见表 2。样品盐酸水苏碱含量的 RSD 是 0.69%，表明本法重复性良好。表 2盐酸水苏碱重复性测定结果表盐酸水苏碱含量/%RSD/%0.930.690.920.920.920.920.912.3.4准确性精密称取已知含量的同一批益母草粉末（过三号筛）6 份（每份约 1 g），每份加入盐酸水苏碱4.008 mg，按1.3.3项下方法操作，按1.3.1色谱条件测定，计算回收率，结果见表3。盐酸水苏碱的平均回收率是 100.28%，RSD 为 1.43%，表明本法准确性良好。表 3盐酸水苏碱准确性测定结果表称样量/g本底值/mg加入量/mg测定量/mg回收率/%平均回收率%RSD/%1.00028.4574.00812.575102.74100.281.431.00028.4574.00812.490100.621.00048.4594.00812.42598.951.00048.4594.00812.485100.451.00058.4604.00812.475100.171.00028.4574.00812.41598.752.3.5稳定性对同一供试品溶液，分别于 0 h、3 h、6 h、12 h、18 h 和 24 h 的 6 个时间点，按 1.3.1 色谱条件测定，测定结果见表4。盐酸水苏碱峰面积的RSD为0.58%，可表明益母草供试品溶液中盐酸水苏碱成分能在 24 h内保持稳定。表 4稳定性测定结果表时间/h峰面积/pA*minRSD/%018.7580.58318.576618.5221218.5681818.6442418.4422.4样品的测定对 6 批次益母草样品中盐酸水苏碱含量进行测定，结果见表 5。结果显示，各批益母草的 CAD 法结果与ESLD 法结果的相对平均偏差为 0%1.08%，表明采用 CAD 法结果与 ESLD 法结果基本一致。另对 6 批次的 CAD 法与 ELSD 法 2 组结果使用 SPSS 22 进行独立样本 t 检验，结果显示 Levene 统计量为 1.509，显著性 P 值为 0.247 0.05，故方差齐性；两组间独立样本 t 检验统计量 t=-0.276，P 值为 0.065 0.01，表明 CAD 法结果与 ESLD 法结果不存在差异。表 5含量测定结果表益母草批次盐酸水苏碱含量/%相对平均偏差/%CAD 法ELSD 法10.930.940.5320.930.93030.930.940.5340.930.940.5350.920.92060.920.941.083结论近年来，电雾式检测器作为一种新型通用型检测器在中药分析领域表现出了广泛的适用性，尤其适用于皂苷、糖类和生物碱类等无紫外吸收或弱紫外吸收成分的分析与检测11。虽然电雾式检测器与紫外检测器、蒸发光检测器等检测器相比具有较大的优势，但其缺点也同样明显，如待测物需先经干燥，故难以检测挥发性物质；该监测器基于气溶胶方法获得的浓度和峰面积均为非线性关系，在实际计算中不如紫外检测器简单方便，在识别某个峰或进行峰纯度分析时也不能像质谱探测器能深度探索12。但在实际使用当中可以看出，电雾式检测器已逐渐成为目前检测器分析中的重要补充，对提高准确度、扩大检测范围起到重（下转第133页）现代食品XIANDAISHIPIN133/分析检测AnalysisandTesting参考文献1 国家卫生健康委.关于蝉花子实体（人工培植）等 15 种“三新食品”的公告（2020 年第 9 号）J.饮料工业，2021，24（1）：68.2 王胜男，宫建辉，徐熙明，等.透明质酸钠功能机制及其在食品中的应用进展 J.食品安全导刊，2022（11）：181-183.3 郭玉华，刘扬瑞，李钰金.鱼类胶原蛋白及胶原活性多肽的研究进展J.中国食品添加剂，2010（3）：175-179.4 郭瑶，曾名勇，崔文萱.水产胶原蛋白及胶原多肽的研究进展 J.水产科学，2006（2）：101-104.5MAEDA K.Skin-moisturizing effect of collagen peptides taking orallyJ.Journal of Nutrition&Food Sciences，2018，8（2）：1000682.6 国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 糖果：GB 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