生物化学技术10--固定化的酶与微生物.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章,固定化的酶与微生物,一、固定化的酶与固定化微生物的概念,是一类由生物细胞产生的具有催化功能的生物大分子（蛋白质），通常称作生物催化剂,酶:,是用适当的物理、化学方法把纯化的,微生物,固定于一定的空间内，使其成为既保持了本身的特性，又能在连续反应之后可以回收和重复使用的一种制品,固定化微生物,固定化酶和固定化微生物的研究历史,:,1916,年,Nelson,和,Griffin,发现,:,有些酶虽然不溶于水，但是仍存在催化活性现象,1953,年,Grubhofer,和,Schleith,真正开始固定化酶的研究,1960,年之后，,Katzir-Katchalski,学派对酶的固定方法和固定化酶的理化性质做了大量的工作，并将其成功地应用于工业生产,1969,年千烟一郎也成功地将固定化氨基酰化酶应用于,DL-,氨基酸的光学拆分过程，使其反应实现了连续化,1973,年千烟一郎研制成了大肠杆菌,(E,coli),的固定化细胞，即所谓,固定化微生物,，并将其用于连续生产,L-,天门冬氨酸过程。,固定化微生物虽然仅较,适用于催化小分子物质的转化,，并伴随发生分解生成物等,副反应,，但它工序简单、稳定性好、酶活力丧失少、成本低廉，以及利用其固有的多酶系统可对有机体的代谢途径进行研究,固定化微生物的特点,:,本章将就固定化的酶与微生物的制备方法及其,制品的性质和应用进行讨论,三、固定化酶,的制备,（二）,酶的固定化方法,固定化酶制备方法，根据制备原理分类：,1,载体结合法,(1),物理吸附法,载体类型：,是将酶蛋白吸附到水不溶性的惰性载体,(,它是以共价或非共价键结合其他物质的一种基质,),上制成固定化酶的过程。,制备原理：,常为疏松多孔的吸附材料；如：多孔玻璃、活性炭、酸性白土、羟基磷灰石、磷酸钙凝胶以及淀粉等物质。,酶与载体的相互作用较弱，二者之间易于分离。,缺 点：,酶活力不易丧失，蛋白质的空间结构不发生明显变化。,优 点：,(3),共价结合法,是将酶的非必需基团,(-,氨基，,-,氨基，,、,、,-,羧基，羟基，咪唑基等,),通过共价键或整合剂偶联于固相载体上而制成固定化酶。,制备原理：,有硅胶、纤维素、琼脂糖和交联葡聚糖，以及聚丙烯酰胺凝胶等物质。,酶与载体结合很牢固，使用周期长（该法目前应用较为普遍）。,优 点：,载体类型:,操作较复杂、条件较剧烈、酶活力丧失较多。,缺 点：,根据偶联反应方式类型的不同，可将共价结合法分为：,共价结合法,重氮法,多肽法,烷化法,缩合剂法,载体交联法,叠氮法,卤化氰法,载体共价交联法,“酶网载体法,重氮法,制备原理：,常用载体:,先将载体（带氨基的芳香族化合物,R-Y-NH,2,）,用稀盐酸和亚硝酸钠（相当于亚硝酸）处理生成重氮盐化合物,，,然后与酶蛋白的酚基、咪唑基发生偶联反应,(,游离氨基也能发生十分缓慢的反应,),，制成固定化酶（形成偶氮化合物）,有对氨苄基纤维素、聚氨基聚苯乙烯、,3-,对,-,氨苯氧基,-2-,羟丙酰纤维素、氨基酸共聚物、交联葡聚糖,-,氨茴香酸酯等,弱酸性环境,加入酶蛋白，低温（,05,）,多,肽,法,利用肽的合成原理，使酶蛋白和载体之间以肽键连接而制成固定化酶的过程。它又分叠氮法和卤化氰法等,叠 氮 法,先用羧甲基纤维素甲酯与水合肼作用形成酰肼，然后再与亚硝酸反应得到叠氮化合物，再在低温条件下，该化合物和酶的游离-,NH,2,、-,OH,和-,SH,反应形成肽键，即偶联成固定化酶,卤化氰法,此法与第七章“亲和层析”中亲和吸附剂的制备原理相似。先用卤化氰,(,常用的是溴化氰,CNBr,),活化纤维素、交联葡聚糖和琼脂糖等多糖类载体，然后在偏碱性环境条件下，使载体（基质）与酶（配体）进行偶联，即可制成固定化酶,缩合剂法,将酶（含-,COOH,和-,NH,2,）,与含-,NH,2,和-,COOH,的载体（,R-NH,2,或,R-COOH,）,在缩合剂碳化二亚胺（,R,1,-N=C=N-R,2,）,或伍德沃德试剂,K(N-,乙基-5-苯异口恶唑-3-磺酸)作用下进行缩合反应，制成固定化酶,制备方法：,载体交联法,这种制备固定化酶的方法有的地方把它归到交联法。,因为它们都是通过一个中间工具“交联剂”（如戊二醛等）将酶固定化的。载体交联法是在酶与载体之间进行交联，使酶固定化；而交联法是在酶分子与酶分子之间进行交联，制成网状结构的固定化酶,3、包埋法,定义：,就是将酶包裹到高分子凝胶等物质的细微网格中，或包埋到高分子半透膜中制成固定化酶的方法,分类：,包埋法根据包埋分式不同分为网格型和微囊型,由于包埋法,制备固定化酶的过程中，酶本身不发生物理化学变化，故其活力回收率较高，适用于固定各种类型的酶。目前应用较多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、天然琼脂糖和淀粉等，用其制备固定化酶的操作简单,这种固定化酶制品却只能应用于底物和产物的分子质量都小的反应中,优点：,缺点：,采用包埋法制备的部分固定化微生物及其用途,五、固定化酶和固定化微生物的性质,（一）相对活性,固定化酶,(,或微生物,),的活力，通常用“相对活力”表示，即以固定化酶,(,或微生物,),的活力与同样量游离酶活力之比称为相对活力；一般用百分数表示。以游离酶,(,或微生物,),的活力为,100,作比较,概念：,（二）活力曲线与最适,pH,值,固定化酶,(,或微生物,),的活力曲线与最适,pH,值的变化：,酶,(,或微生物,),固定化后，其活力曲线和最适,pH,值，一般会发生偏移,活力曲线和最适,pH,值偏移的原因：,酶固定化后，部分氨基酸侧链和酶分子的净电荷发生了改变，随之酶活性基团的解离值,(,pK,),也改变；而酶的活性与其解离状态相关；,由于载体的理化性质受到影响，致使固定化酶颗粒扩散层内外的,H+,浓度产生差异，其中多阴离子衍生物载体带负电荷，最适,pH,值向碱侧偏移，而多阳离子衍生物载体带正电荷，最适,pH,值则向酸侧偏移；,酶反应产物导致固定化酶颗粒内带电微环境的改变（在大多数情况下，固定化酶的活力曲线要比游离酶陡峭）,的解释：,在固定化酶反应体系中，酶颗粒周围存在一个极薄的扩散层，带电的载体使固定化酶微环境中的带电状态不同与外环境。带负电荷的载体会使料液中,H,+,局部集中于扩散层，使固定化酶微环境的,PH,值低于外侧料液的,PH,值；为了抵消这种影响，需提高料液的,PH,值，才能使固定化酶达到最大的催化速度；所以，带负电荷的载体通常使固定化酶的最适,PH,值向碱侧偏移，而带正电荷的载体则通常使固定化酶的最适,PH,值向酸侧偏移,活力曲线和最适,pH,值偏移的表现,综上情况可以看出，酶,(,或微生物,),经固定化后，其活力曲线和最适,pH,的变化是有一定规律的。因此，当酶的最适,pH,与其所处的环境,pH,不相同时，可通过选择适当的载体进行固定，以改变其最适,p,值，使之与环境相一致，从而使固定化酶活力达到最大。,特点：,固定化酶的稳定性一般都优于游离酶但是，也有的酶在固定化后，稳定性降低了。,固定化微生物的稳定性，基本上与固定化酶相近。,固定化酶稳定性提高的原因可能是：,带电荷载体与酶分子之间产生了静电作用，对酶的特定空间构象起到稳定作用,蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化现象发生,固定化以后，由于空间位阻，降低了变性剂、解离剂、有机溶剂等对酶的进攻破坏 作用,（三）稳定性,（四）米氏常数,米氏常数（,K,m,）,是酶的一个特征性常数,，每一种酶都有一定的,K,m,值，其倒数1/,K,m,称为亲和常数，,用来表示酶与底物的亲和力,；而固定化酶的,K,m,值和最大反应速度（,V,m,）,常因酶蛋白结构的变化和载体带电荷的影响而变化。,此外，,随着反应体系离子强度的增大，或者载体粒度的增大，米氏常数也会增大,。一般，载体的颗粒越小，固定化酶越接近游离状态的酶，米氏常数就越接近。,固定化酶的最大反应速度与游离酶相比,，要依具体情况而定。大多数酶经固定化以后，,V,m,变化不大,，但也有由于固定化方法不同而有差异的。如：以多孔玻璃为载体共价结合的转化酶，其,Vm,与游离酶相同；但用,PEAE,凝胶包埋的转化酶，其,Vm,却只 相当于游离酶的1/10。,（五）其 他,1、,PH,值的影响：酶用带负电荷的载体固定时，在偏酸性环境条件下可增加固定化酶的稳定性；相反，酶用带负电荷的载体固定时，在偏碱性环境条件下可增加固定化酶的稳定性,2、酶固定化以后，抗氧化能力增强,3、固定化微生物，如含精氨酸脱亚胺酶的恶臭假单包菌，用,PEAE,凝胶包埋后，由于细胞膜结构发生改变，导致起对底物（,S）,和产物（,P）,的选择性丧失，从而提高了固定化微生物的相对活力,六、应用,固定化酶,(,或微生物,),比游离酶,(,或自然微生物,),不但稳定性好，而且与底物和产物更容易分开，所以在工业、医学、药学和生化分析等方面的应用发展较快,（一）工业方面应用,由于酶固定化以后，既稳定，又容易与,S,和,P,分离，并且可以重复使用；所以固定化酶在工业上的应用既经济又实用,例1、,L-,氨基酸的生产是利用固定化氨基酰化酶反应进行的,生产步骤：,先将氨基酰化酶,吸附于,DEAE-,交联葡聚糖,A-25，,制成固定化酶反应柱，在柱中通入,DL-,氨基酸的,N-,酰化衍生物，然后采用溶解度法把,L-,氨基酸和酰化-,D-,氨基酸分开（这样就得到了光学纯度好，回首率高的,DL-,氨基酸）,例2、,利用固定化多酶反应柱生产3-磷酸甘油醛,多酶反应柱，从上到下依次分别为用聚丙烯酰胺凝胶包埋的己糖激酶、磷酸己糖异构酶、6-磷酸果糖激酶-1、醛缩酶（裂解酶）。当向反应柱注入一定比例的,G、ATP、Mg,2+,混合时，这些底物原料流经反应柱时，依次被己糖激酶、磷酸己糖异构酶、6-磷酸果糖激酶-1和醛缩酶催化反应，生成3-磷酸甘油醛,（二）医学方面,固定化酶在医学方面的应用，目前正在积极的研究和开发。其中用包埋法制备的固定化酶，在治疗酶缺乏症和代谢异常症等疾病时，有很好的发展前景。,例1,在小白鼠腹腔内，分别注射生理盐水、游离的和固定化的天冬酰胺酶后，饲养观察的结果如图,10-8,所示,从图中可看出：使用游离天冬酰胺酶的药效时间为2天，而使用固定化天冬酰胺酶的药效时间为6天，明显延长了药效时间,机体正常的体细胞能合成足量的,Asn,供蛋白质合成使用，但白血病病变细胞却不能合成,Asn，,必须不断从血液中摄取,Asn,供病变细胞蛋白质合成。因此，临床上应用天冬酰胺酶使,Asn,水解为,Asp，,减少血液,Asn,的含量，使病变细胞蛋白质合成受阻，达到治疗的目的,例2 人工肾便,尿毒症患者就是由于肾脏病变，体内的代谢废物如尿素、尿酸等不能随尿排出体外，传统的方法就是“透析”，即利用半透膜将血液中的代谢废物排除。这种方法病人很痛苦，使用不方便，并且成本很高；而,新型,人工肾,是由微型胶囊脲酶和微型胶囊吸附剂离子交换树脂或活性炭构成的，将其装于体外血管分流器内，并与循环系统连接，体积约为,1,立升，可随身携带。并且由于固定化酶可重复使用，离子交换树脂可再生，所以此法比透析法效率高、成本低、使用方便,（三）生化分析方面,1,定量分析,定量分析是将固定化酶分别与分光光度计、荧光光度计和微量热量计等仪器组合起来，进行含量检测的一种自动分析方法。目前这种分析方法正在临床检验中应用。,例如，,在固定化胆碱酯酶中，通人一定体积的空气或水，根据荧光分析测定结果，便可得知其中对人有害的胆碱酯酶神经毒剂,(,酶抑制剂,),的含量,现在国际上已用固定化酶对体液和排泄物中的过氧化氢、尿素、乳酸、葡葡糖和氨基酸等物质进行自动分析测定,(,见表,10-6),。,。,2,制作酶电极,将固定化酶覆盖在电极上，或将酶固定在电极上构成的装置称酶电极，也称酶传感器,3,分析物质的结构,将分析蛋白质和核酸一级结构的蛋白水解酶、羧肽酶、亮氨酸氨肽酶、核酸酶、磷酸二酯酶和磷酸单酯酶等分别制成固定化酶，在应用时比游离酶操作简单，分离方便,4,研究酶的功能和反应机理,采用固定化酶可以研究酶的功能和反应机理,例如,为了研究某些酶的亚单位功能，可将具有,4,个亚基的醛缩酶固定到琼脂糖上，制成固定化的醛缩酶,(s),。将此酶经含巯基乙醇的,8mol,L,尿素溶液处理后，得到变性的固定化亚单位,(b),。然后经透析和再生，则分别得到了固定化亚单位,(c),和再生固定化醛缩酶,(d)(,见图,10-9),。,(a),、,(c),和,(d),三者的比活力分别为,4.5,、,1.6,和,2.2u,mg,蛋白。这表明构成醛缩酶的亚基,(,即亚单位,),是有酶活性,5,制备亲和吸附剂,有些物质如酶和底物,(,或竞争性抑制剂,),、抗原和抗体、激素和受体蛋白、,DNA,和,RNA,等具有某些生物学特性，即每一对物质之间存在着很高的特异结合能力。如果将酶用适当的载体固定后，制成的,亲和吸附剂,就能把类似,底物,从混合物中分离出来。,（四）应用实例,固定化,5,-,磷酸二酯酶的制备,(,重氮法,),材料准备,酶固定化,酶活力测定,粗酶液的制备,双功能试剂,SESA（,对,-,硫酸酯乙砜基苯胺,）的配制,载体（,葡聚糖凝胶,G-200,）的制备,载体的活化（制备,SESA,葡聚糖凝胶,G-200,载体,）,原酶液活力测定,固定化酶活力测定,残留酶活力测定,相对酶活力和回收率的计算,1、粗酶液,制备,将桔青霉菌,(,Penicillium citrium),发酵液用（,NH,4,）,2,SO,4,盐析，或用的冷乙醇沉淀分离得到酶,2、双功能试剂的预处理,取,5,g SESA,（,对,-,硫酸酯乙砜基苯胺）,加,10,ml,水研磨，随后慢慢加入含,2,Na,2,CO,3,的,0.1,mol,L,的,NaOH,溶液,40,ml,混匀，收集悬液，弃去残渣。,3、载体的处理,取,10,g,Sephadex,G-200(,粉末状,150-200,目,),凝胶,，,加水,200,mi,浸泡,1,2,h,后，加含,2,Na,2,CO,3,的,0.1,mol,L,Na,OH,溶液，室温放置过夜，使其充分溶胀,4、载体的活化,将溶胀好的碱性,Sephadex,G-200,凝胶置沸水浴中搅拌，当加温到,50,时，逐渐加入,SESA,悬液，用含,2,Na,2,CO,3,的,0.1,mol,L,Na,OH,溶液调,pH,值为,8,，待加温到,80,时，保持,20,min,，,尔后继续加温到,90,，维持,6,min,，,接着开始降温冷却，并依次用,0.1,mol,L,Na,OH,和,0.1,mol,L,HCL,溶液各,700,ml,，,洗,3,次，再用水洗至,pH4.0,左右,5、酶固定化,取上述,SESA-,Sephadex,G-200,载体,2,g(,离心后湿重,),于冰浴中冷却，加,5,Na,2,NO,2,溶液,0,5,ml,，,搅匀并滴加,1,mol,L,HCL,0,5,ml,，,搅拌,10,min,后，用冷的,0.05,N,HCL,洗三次，冷水洗一次。在,0,5,用,1,mol,L,Na,2,CO,3,溶液,调,pH6.07.0,，,立即加入酶液,lml,（10mg/ml）,合并洗涤液，用作测定残留的酶活力（固定化的5-磷酸二酯酶呈鲜艳的桔红色。按此程序，用20,ml,酶酸液可制成39,g,固定化酶，并得到74,ml,固定化酶的洗涤液）,6、酶活力的测定,取洁净试管，加入0.125,molL,乙酸缓冲液(,pH5.1)1.9ml(,内含1酵母,RNA,和1,mmolL ZnSO,4,)，67,预热5,min，,加,酶,液(,稀释10倍,)0.1,ml(,即反应总体积,20,ml,),；反应15,min，,加0.25钼酸铵-2.5过氯酸试剂2,ml,终止反应。置水浴,l0min，,使其,(,产物,),沉淀完全，离心(2000,rmin)l0min，,取上清液0.2,ml，,加水9.8,ml，,摇匀；以先加反应终止剂，后加酶液同法制成的溶液作为空白对照，于,260,测得消光值,A,260,=,0.555。然后计算原酶活力,（1）原酶液活力测定,(20ml),注意：,A,260,=,反应前的,A,260,-,反应后的,A,260,酶活性单位：,在规定条件下，每分钟催化1,mol,底物转化为产物所需的酶量为一 个,IU（,讲义上是：在,规定的反应条件下，每分钟使消光值增加,1.0,所需的酶量称为一个酶单位）,酶活力单位计算公式为:,比色液稀释倍数总体积,原酶液总活力单位（,）,=,50,20,=14800,（2）固定化酶活力测定,取底物溶液,20,ml,置烧杯中，,67,预热,5,min,，,加固定化酶,0.50,g(,滤纸吸干,),反应,15,min,，,立即过滤，取滤液,2,ml,，,加水98,ml,然后同上法测定,260,处的消光值为,A,260,=,0.605，计算固定化酶总活力单位。,固定化酶总活力单位（,b,）=,50,39=6286.2,取,0.2,ml,洗涤液，,不加稀释,（因为洗涤液中酶的含量比较稀）直接加入反应，按上述程序进行测定，测得,A,260,为,0.245,。,（3）残留酶,(74,ml,未偶联部分,),活力测定,洗涤液总酶活力单位,(,c)=,50,74=1206.2,（4）相对酶活力和回收率,计算,固定化酶活力占实际偶联到固定化载体上酶活力的百分数,相对酶活力,固定化酶活力占原酶液总活力的百分数,回 收 率,相对酶活力,=,100%=47%,回收率,=,100%,=,100%,=,100%,=43%,