微生物实验(六).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,微生物学实验六,指导教师：宋勇春,本周实验内容,实验六：,长江沿岸优势土壤微生物种群分析,形态、大小、数量、保存,1.,细菌大小的测定（见,P47,实验八）,2.,微生物计数方法（见,P51,实验九）,3.,微生物的保存技术（见,P266,）,【,实验目的,】,1,、了解目镜测微尺和镜台测微尺的构造及使用原理，掌握测定微生物细胞大小的方法。,2,、了解血球计数板的构造、计数原理和计数方法，用显微镜直接测定微生物总细胞数。,微生物细胞的大小是微生物基本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。,目镜测微尺是一块圆形玻片，在玻片中央把,5mm,长度刻成,50,等分，或把,10mm,刻成,100,等分。,测量时，将其放在接目镜中的隔板上,(,此处正好与物镜放大的中间物像重叠,),用于测量经显微镜放大后的细胞物象。由于不同目镜、物镜组合的放大倍数不相同，目镜测微尺每格实际表示的长度也不一样，因此目镜测微尺测量微生物大小时须先用置于镜台上的镜台测微尺校正，以求出在一定放大倍数下，目镜测微尺每小格所代表的相对长度。从镜台测微尺上得到的读数就是细胞的真实大小，所以用镜台测微尺的已知长度在一定放大倍数下校正目镜测微尺，即可求出目镜测微尺每格所代表的实际长度，然后移去镜台测微尺，换上待测标本，用校正好的目镜测微尺在同样放大倍数下测量微生物细胞的大小。,换算公式：,目镜测微尺每格长度,(,m)=,两重合线间镜台测微尺的格数,10/,两重合线间目镜测微尺的格数,【,实验原理,】,测微尺的使用,（,1,）目镜测微尺的校正,找准视野、定位重合、换算实际长度。,（,2,）细胞大小的测定,稀释、浸片、在,100,倍油镜下测定、换算。,测定的工具：目镜测微尺 镜台测微尺,实验5-,1,实验程序,（测定微生物的大小）,目镜测微尺的校正：在高倍镜下，看清镜台测微尺的刻度后，转动目镜，使目镜测微尺与镜台测微尺的刻度平行，移动推动器，使目镜测微尺的0点与镜台测微尺的某一刻度重合，然后，仔细寻找两尺第二个完全重合的刻度。计算两刻度间目镜测微尺的格数和镜台测微尺的格数。由于镜台测微尺的刻度每格长10,m，,所以可得：,目镜测微尺每格长度（,m）=（,镜台测微尺格数10）/目镜测微尺格数,注意：校正目镜测微尺必须针对特定的显微镜和附件（特定的接物镜、接目镜、镜筒长度等）进行，而且只能在这,特定的情况,下才可重复使用。,菌体大小的测定：取下镜台测微尺，将细菌染色标本置于载物台上，然后在油镜下用目镜测微尺测量菌体的长和宽。,实验5-,2:,测定微生物数量,实验5-,2,实验程序,（测定微生物数量）,方法：活菌计数法平板菌落计数法；总菌计数法血球计数板或霍瑟（,Peroff Hausser）,细菌计数板（二者原理和部件相同，只是厚薄不同而已）。,实验程序,1,（测定微生物数量）,1.,取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。,2.,取酵母菌液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使菌液,自行渗入,，计数室内不得有气泡。,3.,静止5,min,后,，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。,4.,在高倍镜下计数：随机计数,五个中格的平均值,，然后求得每个中格的平均值。乘上16（或25）就得出一大格中的总菌数，最后再换算到每,mL,菌液中的含菌数。,实 验 程 序,2,5.,计算方法：,6.,注意事项：压在方格线上的菌体，以,压在底线和右侧线,上的菌体计入本格内；遇到有芽体的酵母时，若芽体和母体同等大，就按单个酵母计数。,7.,计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内。,（X1+X2+X3+X4+X5）,5,*25（,或16）,*10*,1000*,稀释倍数,酵母菌细胞数/,mL=,实验5-,3,：美蓝染色死活细胞鉴定,美蓝为无毒染料，其氧化型呈蓝色，还原型无色。,通过美蓝染色，检验细胞的还原能力。活细胞还原能力强，在特定时间内将美蓝还原为无色。,老化、死亡细胞呈蓝色、淡蓝色。,思考题,为什么目镜测微尺必须用镜台测微尺来校正？,在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点？,性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则,生产或科研都无法正常进行。,影响微生物菌种稳定性的因素：,a）,变异；,b）,污染；,c）,死亡；,微生物的保藏技术,1）,从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有,原有典型性状的菌种。,2）有意识地利用微生物会发生自发突变的特性，在日常的菌种,维护工作中不断筛选,“,正变,”,个体。,大量群体中的自发突变,菌种的复壮：,a）,纯种分离；,b）,通过寄主体进行复壮；,菌种衰退的特点：,防止衰退的措施,1）,减少传代次数；,2）创造良好的培养条件；,3）经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查；,4）采用有效的菌种保藏方法；,菌种保藏（,p266,）,在一定时间内使菌种不死、不变、不乱,基本要求：,基本方法：,生活态,休眠态,培养基传代培养,寄主传代培养,冷冻,干燥,斜面、平板,液氮、低温冰箱,沙土管、冷冻真空干燥,菌种保藏,由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同,的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适,宜。因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏,物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一些比较重要的微,生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因,某种方法的失败而导致菌种的丧失。,大小：酵母、,E coli.,、枯草（平皿、试管均可）,计数：酵母、枯草（液体）,保存：甘油、石蜡等,注意：,适当稀释,2.,液体不要加太多,【,实验内容,】,实验七八：,微生物代谢研究技术,下周实验,