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,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,细胞分子生物学研究方法,实验动物,主要内容,第一章 绪论,一、实验动物定义,二、实验动物发展趋势,三、实验动物分类,四、实验动物福利,五、常用动物模型小鼠,第二章 基因修饰小鼠,一、转基因小鼠,二、基因敲除小鼠,三、在生物医学中的应用,第三章 实例分析,一、FGFR4基因敲除小鼠,二、FGFR4 转基因小鼠,参考书,现在医学实验动物学概论,王钜等主编 中国协和医科大学出版社,实验动物学（第,2,版）,郝光荣主编 第二军医大学出版社,实验动物学,邹移海等主编 科学出版社,实验动物学,刘福英等主编 中国科学技术出版社,实验动物,是生命科学研究的重要基础和手段。在生命科学领域内，目前公认,“AEIR”,是进行生命科学实验研究所必需的四个基本条件。,“E”系Equipment（设备）,“I”为Information（信息）,“R”是Reagent（试剂）,“A”即Animal（实验动物）,一、实验动物定义,实验动物（,Laboratory Animal,）,是指经人工繁育、对其携带微生物实行控制，遗传背景明确或者来源清楚的用于科学研究、教学、生产、鉴定以及其他科学实验的动物。,实验用动物（,Experimental Animals,）,是指一切用于各种实验的动物，其中除了符合严格要求的实验动物外，还包括经济动物、野生动物和观赏动物。,二、实验动物发展趋势,（一）国外发展趋势,1.实验动物使用总量下降，高质量实验动物使用量增加,近20年，实验动物使用总量减少了约50%，但高质量实验动物使用量呈上升趋势，普通级、清洁级动物逐步被SPF（Specific Pathogen Free）级取代。,2.实验动物品种、品系增加,目前，国外实验动物种系已超过3000种。,其中,小鼠,近交系及各种突变系 2500 余个,大鼠近交系 111 个,地鼠近交系 45 个,豚鼠近交系 14 个,家兔近交系 20 个,鸡近交系 40 个,（二）国内发展趋势,1.加大对实验动物工作的依法管理力度,2.强化实验动物的质量，积极开展科学研究,3.加速实验动物商品化、社会化和产业化进程,（二）实验动物学分类,根据遗传特征将动物在种以下细分为,品种,和,品系,品种,是人们根据不同需要而对动物进行改良、选择，即定向 培育，并具有某种特定外形和生物学特性的动物群体，其特性能较稳定地遗传。,如根据小鼠的毛色划分为白化小鼠和其他毛色小鼠。,品系,即“株”，为实验动物学的专用名词，指来源明确，并采用某种交配方法繁殖，而具有相似的外貌、独特的生物学特征和稳定的遗传特性，可用于不同实验目的的动物群体。,如近交系、杂交群、封闭群等。,近交系（Inbred strain）,1.定义：,是经连续20代（或以上）的全同胞兄妹交配（或亲代与子代交配）培育而成的动物，品系内所有个体都可追溯到起源于第20代或以后代数的一对共同祖先。,1909年，C.C.Little首先采用近亲繁殖，培育了DBA近交系小鼠，成为实验动物发展史上第一个近交系动物。,2.命名：,根据动物的来源、历史和培育经过，以一系列字母和数字作为品系代码（strain code）来表示。,以一个或数个大写英文字母表示，如DBA,大写英文字母加数字命名，如C57BL,有些品系的代码在此规定制定前已广为人知，故延用至今，如615,有时可标注近交代数，通常在品系代码后加括号，先写“F”，后写代数，如615（F25）,C57BL/6J,C代表 Cold Spring Harbor Laboratory（冷泉港实验室），57为第57号雌鼠，BL即Black（黑色），6为亚系，J代表Jackson实验室,DBA/1fLACA/Lac,DBA为小鼠近交系名称，1表示亚系，f表示代乳，LACA为代乳母鼠的品系，Lac代表培育单位名称（英国实验动物中心）,基因位点的纯合性（,Homozygosity,）,近交系动物中任何一个基因位点上纯合子的概率高达,99,，因而也能繁殖出完全一致的纯合子后代。,遗传组成的同源性（,Isogenicity,）,品系内所有动物个体都可追溯到一对共同祖先，个体在遗传上是同源的，基因型完全一致,表型的一致性（,Uniformity,）,由于基因型的一致，近交系个体的表型也是相同的，在实验中用较少的近交系动物就可获得具有统计意义的结果。,对外界因素的敏感性（,Sensitivity,）,由于近交系某些生理功能的稳定性降低，对外界环境因素变化的反应更为敏感，这使近交系更容易被制备成疾病模型动物。供研究使用。,3.特性,遗传特征的可辨性（,Identifiability,）,每个近交系都有自己的标准遗传概貌，选择适当的遗传监测方法，即可分辨各个近交系。,遗传组成的独特性（,Individuality,）,每个近交系都具有独特的遗传组成和独特的生物学特性。由于这一特点，采用某近交系所作的实验结果往往不直接代表整个种属的反应，而必须在多个近交系作动物实验，以增加其代表性。,分布的广泛性（,Extensity,）,同一品系在不同地区不同国家都广泛存在，引种方便并利于研究结果的交流。,背景资料的可查性（,Accessibility,）,具有一份完整的研究背景资料，便于实验设计和结果分析。,5、应用优点,（1）遗传组成和遗传性状一致，对实验反应一致，因此，只需用少量的动物就可得到非常规律的实验结果。,（2）组织相容性抗原一致，异体移植不产生排斥反应，是组织细胞和肿瘤移植实验中最为理想的材料。,（3）明显的生物学特征，如先天畸形，高肿瘤发病率，对某些因子敏感和耐受等，这些特点在医学研究中是天然模型。,（4）多个近交系同时使用不仅可分析不同遗传组成对某项实验的不同反应与影响，还可观察实验结果是否具有普遍意义。,封闭群（Closed colony）,1.定义：,又称远交群（Out stock）指,一个与外界隔离的动物群体,以,非近亲交配方式进行繁殖产生的一个种群。,不从外部引入新的个体，即不引入新基因，同时避免近亲交配，不让群体内基因丢失。,至少连续繁殖4代以上的动物。,2.命名：,有24个大写英文字母命名，种群名称前标明保持者的英文缩写名称，第一个字母须大写，后面的字母小写，一般不超过4个字母，保持者与种群名称间用冒号分开。如，N:NIH表示由美国国立卫生院（N）保持的NIH封闭群小鼠。,3.特点及应用,（1）封闭群动物的遗传组成具有很高的杂合性，在人类遗传研究、药物筛选和毒性实验等方面有着不可代替的作用。,（2）封闭群动物具有较强的繁殖力和生命力，广泛应用于实验，教学等实验中。,（3）突变种所携带的突变基因通常导致动物在某些方面的异常，从而可成为生理学、胚胎学及医学研究的模型。,四、实验动物福利,动物福利（Animal Welfare）,即维持动物生理与心理的健康与正常生长所需之一切事情。其实质指保障实验动物不受虐待并得到合理的照料。,目前，美国、英国大多数欧洲国家和日本都颁布了有关动物福利的条例及法规，以确保动物在实验过程中享有合理的福利。,英国 1876年虐待动物条例1876,美国 1966年实验动物福利法案,我国 1988年实验动物管理条例，这是我国第一部有关实验动物的法规,我国 2006年 关于善待实验动物的指导性意见,有关动物福利的条例及法规的基本内容,1.条例所管辖的动物包括犬、猫、非人灵长类动物、豚鼠、家兔、水生哺乳动物或其他温血动物。,2.动物经销商和使用者均须持有许可证，动物实验须由合格的生物学家、行为学家、医学家亲自或在场监督下执行。,3.动物饲养设施、关养设备、卫生、喂饲、管理和护理应由符合资格的人员负责。,4.必须确保动物在麻醉、镇痛和镇静剂的作用下进行实验，不使其遭受不必要的伤害或痛苦，麻醉剂的种类和剂量必须被专业兽医认可。,5.需要处死的动物须用人道的方法实施，并在确保死亡后方可焚化处理。,6.有关监督机构应定期进行检查，对违反动物福利条例的单位或个人将给予处罚。,近年来越来越多的人提倡“3R”，即代替、减少和优化原则,代替（Replacement）原则,要求尽可能采用低等实验动物或非实验动物，以代替高等实验动物进行实验。,减少（Reduction）原则,要求尽可能较少实验动物的用量，甚至可以降低统计学要求。,优化（Refinement）原则,要求优化实验设计和操作，以减轻动物的痛苦。,一、生物学特性和解剖生理特点,（一）外貌特征,面部尖突，其前部有长的触毛，耳耸立呈半圆形，尾巴长约与体长相等，眼睛大，嘴尖，被毛颜色有白色、棕褐色、黑色等等。,（二）习性,习于昼伏夜动，胆小怕惊，对外界环境反应敏感，适应性差，强光或噪声刺激时，可能导致哺乳母鼠神经紊乱，发生食仔现象。温度过高或多低时，生殖能力下降，严重时会发生死亡。,（三）解剖学特点,1.,在啮齿类实验动物中体型最小，出生时仅1.5g，,11.5,月龄达,1822g,，可供实验使用。,2.,共有牙齿16个，门齿终生不断生长。,3.,小鼠下颌骨的喙状突较小，髁状突发达，运用下颌 骨形态的分析技术，可进行近交系小鼠遗传监测。,4.,小鼠无汗腺。,5.,骨髓为红骨髓而无黄骨髓，终生造血。,6.,淋巴系统发达，外界刺激可使淋巴系统增生，因此易患淋巴系统疾病。,小鼠腹腔器官,2.,体温,小鼠的体温变化较大，但随着年龄的增长而趋于恒定，正常情况下成年的小鼠体温为3739。,3.,胃容量,小鼠的胃容量为11.5mL，食料量2.87g/d，饮水量为47mL/d,4.,染色体,小鼠为20对,5.生殖生理,小鼠成熟早，雌性小鼠3550日龄、雄性小鼠4560日龄性发育成熟，体成熟雌性小鼠为6575日龄，雄性小鼠为7080日龄。小鼠性活动保持1年，繁殖力强，性周期45d，妊娠期1921d，哺乳期2022d，每胎产仔815只。交配后1012小时，雌鼠在阴道口形成一个白色的阴道栓，这是受孕的标志。,6.寿命,小鼠寿命可达1824个月，最长可达3年。,（五）年龄鉴别与性别鉴定,新生仔,周生无毛、皮肤赤红、两眼不睁,有触觉、嗅觉和味觉等等,生后12h,即可吃奶,45d,两耳张开,1周,可爬行，被毛逐渐浓密,8d,长出下门齿,10d,有听觉,12d,开眼,14d,长出门齿,1315d,可开始活动并采食,3周左右,可独立生活,1.年龄鉴别,2.性别鉴定,雄鼠乳头不明显，雌鼠乳头明显,雄鼠生殖器突起，距离肛门较远并较雌鼠大。,雌鼠肛门和生殖器之间有一无毛小沟，雄鼠在肛门和生殖器之间长毛。,二、主要品种、品系,（一）国内外常用近交系小鼠,1.BALB/c系,（1）遗传背景：,起源：Dowell于1913年开始维持的白化小鼠，从1923年开始近亲交配，1932年Snell获得其 26 代近交系。1985年180代从NIH引到IMLAS。近交代数：180(美国 NIH1985)。毛色和毛色基因：白化，AA、bb、cc、DD。主要亚系为BALB/ccd,BALB/cJ,BALB/cAnN等。,（2）特性：,乳腺癌发病率低，与其他品系相比血压较高，对慢性肺炎敏感，对放射线特别敏感，繁殖期长。,（3）应用：,广泛应用于肿瘤学、生理学、免疫学、核医学和单克隆抗体等研究中。,2.C57BL系,毛色 黑色（隐性）,（1）遗传背景：,起源：1921年Little由Abby Lathrop得到动物后开始近亲交配，育成数个近交系，雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL，1937年分开C57BL/6及C57BL/10两系。1985年引到IMLAS。近交代数：150(Jax,1984)。毛色及毛色基因：黑色，aa、BB、CC、DD。主要亚系为C57BL/6J,C57BL/6N,C57BL/10J等。,（2）特性：,乳腺癌发病率低，对化学致癌剂不敏感，全身照射后淋巴瘤发病率99100，干扰素产量高。,（3）应用：,常被认作“标准”的近交系，为许多突变基因提供遗传背景，是肿瘤学、生理学、免疫学、遗传学研究常用品系。,3.129sv 系,毛色 agouti 棕褐色（显性）,应用：1980年代，具稳定性的小鼠胚胎干细胞株皆源自129/Sv纯系小鼠。1990年代，基因定位(gene targeting)试验结果证实其为极成功的动物模型。,4.FVB 系,毛色白化起源 源自远交系Swiss鼠。1935 年，在NIH 饲养，1966 年起开始选育，在接种百日咳疫苗后，其中一系HSFS/N对组胺(Histamine)敏感。70 年代初，在HSFS/N 系第八代发现部份小鼠携带Fv1 b 基因对B strain Friend 白血病毒敏感，后育成Fv1 b 同型合子近交系，称FVB。NIH、Jackson等保存。,应用FVB 通用于转基因实验，有较强的繁殖力，窝仔数多，受精卵有大而显著的前核，易于显微注射DNA。,FVB,3.我国培育的小鼠近交系,1946年，我国从印度Haggkine研究所引入小鼠，这是当今广泛应用的,昆明种,小鼠的原种。,（二）突变系,突变系动物（mutant strain animal）,是由自然变异或人工致畸，使正常染色体上的基因发生突变，而具有某种遗传缺陷或某种独特遗传特点的动物。,裸小鼠,SCID小鼠,快速老化模型小鼠,1.裸小鼠（Nude mice）,（1）来源：,1962年英国格拉斯哥医院的Grist在非近交系的小鼠中偶然发现有个别小鼠无毛，后来证实是由于第11对染色体基因突变所致并伴有先天性胸腺发育不良，称为裸小鼠，用“,nu,”表示裸基因符号。1969年丹麦的Rygaard首先将人结肠腺癌移植裸小鼠获得成功，为免疫缺陷动物的研究和应用开创了新的局面。,（2）特性：,无毛、裸体、无胸腺，缺乏成熟的T淋巴细胞，细胞免疫功能低下,，抵抗力差，生育力低，寿命短，必须饲养在屏蔽环境中。,（3）常用品系：,BALB/c-,nu,NIH-,nu,C3H-,nu,C57BL-,nu,等。,（4）用途：,广泛应用于肿瘤学、免疫学和病毒学等多个学科的研究。,2.SCID小鼠,（1）来源：,SCID小鼠（Severe Combined Immune Deficiency）是严重联合免疫缺陷小鼠。1983年由美国的Bosma首先从C.B-17近交系小鼠中发现认为是位于16号染色体上的SCID的单个隐性基因发生突变所致，SCID小鼠是C.B-17/lcrj的同源近交系。1988年从美国jax实验室进入我国。,（2）特性：,外观与普通小鼠无异，惟胸腺、脾、淋巴结的重量不足正常小鼠的1/3，细胞和体液免疫功能缺陷，容易死于感染性疾病，必须饲养在屏蔽环境中。,（3）用途：,广泛用于免疫细胞分化和功能的研究、异种免疫功能重建，单克隆抗体的制备，人类自身免疫性疾病和免疫缺陷性疾病的研究，病毒学和肿瘤学研究等。,