第十章生物技术与人类健康.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十一章 生物技术与人类健康,基因工程疫苗,基因诊断,基因治疗,第一节 基因工程疫苗,1、,疫苗的概念,：,是一类接种后能激发人体免疫反应来抵抗某些传染病的生物制品。,作用：,疫苗是一种特殊的药物，它不是用于治疗疾病，而是用于预防疾病。,传统疫苗,灭活疫苗,减毒疫苗,新型疫苗,基因工程疫苗,核酸疫苗,生物工程疫苗主要是指基因工程疫苗,2、类型,：,1.减毒疫苗,优点：一般只需接种一次，接种量少，免疫持续的时间长，效果好。,缺点：保留一定的残余毒力，对免疫缺陷者可引起严重感染；个别活疫苗在应用过程中有毒力回升现象；制作时，如果减毒不够会造成被接种者严重感染；过度减毒又会造成免疫原性不足或丧失，失去活疫苗的作用；减毒疫苗需低温保存和运输。,2.灭活疫苗,优点：制备简单，保存时间较长，相对较安全。,缺点：免疫力较差，接种剂量较大且需多次接种。,3、基因工程疫苗,生产过程,：,将病原体的某个或某几个,抗原基因转入,适当的,宿主细胞,，进行表达，,获得,的表达,产物,就可以作为疫苗。,优点：,可删除细菌和病毒中抗原物质的基因或基因片断。,开展基因工程疫苗的研究开发的原则和对策,(1)不能或难于培养的的病原体如乙型肝炎病毒(HBV)，EB病毒(Epstein-Barr病毒，EBV)，巨细胞病毒(CMV)，人乳头瘤病毒(HPV)，麻风杆菌，疾原虫、血吸虫等。,(2)有潜在致癌性或免疫病理作用的病原体，前者如1型嗜人T淋巴细胞病毒(HTLV-I)，人免疫缺损病毒(HIV),单纯疱疹病毒(HSV)等。后者如呼吸道合胞病毒(RSV),登革热病毒(DGV)，肾综合征出血热病毒(HFRSV)；,(3)常规疫苗免疫效果差，如霍乱和痢疾菌苗；或者反应大，如百日咳和伤寒菌苗。,(4)能大大节约成本，简化免疫程序的多价疫苗，如以痘苗病毒，腺病毒，卡介苗或沙门氏菌为载体的多价活疫菌；,种类,基因工程多肽或亚单位疫苗,基因修饰减毒活疫苗,基因重组活疫苗和多价活疫苗,基因重组活疫苗和多价活疫苗,其原理是,将外源性目的基因(保护性抗原基因)插入已知的病毒或细菌的弱毒株或疫苗株的基因组中至使目的基因获高效表达，但不影响原弱毒株或疫苗株的生存与繁殖。,接种了这种重组疫苗以后，体内除了可获得针对原疫苗株的免疫保护之外，还可获得插入目的基因对相关疾病的保护力，目前应用最多的载体为以牛痘苗病毒为载体同时插入和表达了多种病毒的保护性抗原基因，如HAV、HBV，麻疹病毒，型和型HSV、EBV、狂犬病毒等。此外还有用腺病毒/脊灰病毒/轮状病毒/伤寒Tyzla株/鼠伤寒沙门氏菌/株载体,核酸疫苗,核酸疫苗（Nucleic Acid Vaccines）是控制感染因子的一种新型疫苗，包括,DNA和RNA疫苗,。通过DNA重组技术把编码病原体保护性抗原的基因克隆入真核表达载体中。构建核酸疫苗的载体主要有重组质粒型载体和病毒载体（包括逆转录病毒）。尤以前者较多。重组了目的基因的质粒经细菌扩增后，提取质粒DNA并加以纯化，即可制成核酸疫苗用于免疫接种。进入机体的核酸疫苗不与宿主细胞染色体整合，但它能够表达保护性抗原蛋白，刺激机体产生特异性免疫应答，进而使机体产生特异性抗感染免疫力。,第二节 基因诊断,一、基因诊断的概念及常用技术,患者临床表现：中医的望闻问切与西医的影像学检查,细胞形态、生化检测及免疫学检验：生命活动的结构和物质基础,基因诊断的出现：1976年加州大学华裔科学家 Kan YW用核酸分子杂交首次对一例珠蛋白生成障碍性贫血进行诊断,狭义:在基因（DNA或RNA)水平，用PCR、核酸杂交、基因重组、基因芯片等各种分子生物学技术检测特定基因存在与否、结构变异和表达状态的过程，对疾病作出诊断。,基因诊断的概念,与传统诊断的区别：直接以病理基因（致病基因、疾病相关基因和外源性病原生物基因等）为分析对象，即对待诊生物材料某一（些）特定基因进行分析判断。,Essential basis of gene diagnosis,遗传物质改变：,一是,DNA或RNA水平变化,，如病毒基因及其转录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高等；,二是,基因结构变化即突变,，如点突变引起基因失活、染色体转位引起基因异常激活或灭活等。,核酸分子杂交和PCR扩增是基因诊断,的基本技术,核酸杂交的基本过程：,Preparation of Samples and Probes,Prehybridization and Hybridization,Detection and Analysis of the Result,1.制备合适的探针是核酸杂交用于基因诊断的关键,What is a probe?,标记的已知序列核酸片段，包括 DNA,cDNA,RNA,Oligonucleotide,针对具体情况选择合适的探针序列是基因诊断准确、特异、简便、可靠的基础。,2.不同形式的核酸分子杂交,可用于不同的诊断目的,Southern blot:DNA,Northern blot:RNA,FISH:fluorescence in situ hybridization,（二）PCR技术是基因诊断的一种,基础,技术,PCR原理示意图,PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段合成的过程,PCR在基因诊断中的作用,从极少样品即可扩增出肉眼可见的产物。,放大待诊信号，提高检测灵敏度,PCR及其衍生技术,直接运用,PCR,扩增：异常缺失与存在,PCR,产物的限制性酶谱分析（,PCR-RE),和限制性片段长度多态性分析（,PCR-RFLP),RFLP:Restriction Fragment Length,Polymorphism,PCR及其衍生技术,PCRRFLP：通过PCR将包含待测位点的DNA片段扩增后，用识别相应位点的限制性核酸内切酶水解，根据所产生限制性片段的数量和长度作出诊断。,用于已知突变位点的验证性诊断,（三）DNA序列测定是最直接、最准确的基,因诊断技术,病例,SOX9,基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(GT)，如图2所示，左侧正常对照第225位碱基为C，而该患儿为A（反义链中）,例：序列分析用于基因诊断研究,（四）DNA芯片技术是应用前景广阔的基因诊断技术（DNA chips),生物芯片（biochip&bioarray)技术：,根据生物分子间特异性相互作用，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质等各种生物成分的高通量快速检测分析。,疾病诊断芯片,个性化用药芯片,例：基因芯片杂交结果,基因诊断有其独特的优点,高特异性：诊断目标,高灵敏度：分子生物学方法,结果稳定可靠：核酸的化学本质,早期诊断性：分子遗传学规律,应用广泛性：疾病与非疾病检查,基因诊断技术途径：,直接分析致病基因分子结构及表达是否异常的直接诊断途径；,利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析的间接诊断途径。,二 遗传病的基因诊断,直接诊断：检测已知致病基因,必要条件,被检基因的突变类型与疾病发病有直接的因果关系：,被检基因的正常分子结构已被确定；,被检基因突变位点固定而且已知。,1.点突变：,（1）导致特异性限制性内切酶位点改变,（2）无限制性酶切位点改变,直接诊断：检测已知致病基因,在DNA序列上有较长一段序列的重新排布。包括大片段（数十个碱基甚至数千个碱基）的丢失、插入、取代、复制放大和倒位等，这些突变进而引起更大范围内的染色体结构上的改变从而影响多个基因的功能，即染色体突变或畸变，包括染色体的易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等,2.基因重排：核酸分子探针杂交与PCR,（1）Southern 印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号,（2）多重PCR，1988年Chamberlain等采用多重PCR技术成功地同时扩增了人类杜氏肌营养不良蛋白基因的多个基因座,3.基因表达异常,mRNA的相对定量分析,mRNA的绝对定量分析,mRNA长度分析,间接诊断：检测与致病基因连锁的遗传标志,DNA多态性：指群体中的DNA分子存在至少两种不同的类型，即个体间同一染色体的相同位置上DNA核苷酸序列存在一定的差异或变异。,多态性在人群中出现的频率应大于1%（如小于1%常认为是异常突变）。,在生物进化过程中形成的，它本身并不致病或于遗传病有直接联系，故称为“中性突变”。,人类的23对染色体中，每一条上都带有许多遗传多态性位点，其中一些位点在染色体上的位置与致病基因靠的很近，甚至连锁在一起遗传，并且呈孟德尔式遗传。因此，可利用这一多态性位点作为遗传指示标记。,人为什么长肿瘤,物种的进化建立在基因突变的基础之上，但是这必然也可能带来副产品：人类恶性肿瘤的生长。这是人类进化必然要付出的代价。,我们要想根绝肿瘤，是不可能的。,肿瘤发生是生物衰老在基因水平的机理之一，自然界不可能让一个生物长生不死，生生不息。人的免疫功能减退，出现肿瘤，然后死亡，这是自然界宏观的平衡调控机制起作用的结果，包含进化方面的积极意义，这就是为什么自然界要让人类长肿瘤的原因。,三 肿瘤的基因诊断,当前的一个误区是对肿瘤过于偏激，闻癌色变，片面地把它当作深恶痛绝的东西，导致治疗上的误区：想尽办法去杀死它。利用放、化疗技术杀死肿瘤细胞，结果把体内很多良性细胞也杀死了。,把80岁前病故的人都做一遍尸解，就会发现100%的人体内都有肿瘤；人如果活到120岁，体内会有3到4个恶性肿瘤，但不影响生活质量。,许多人不知道自己患有肿瘤，所以没有精神恐惧和巨大的压力。,70、80岁以后长肿瘤，属生理现象，很正常；70岁以前长肿瘤则是是病理性的,肿瘤的危险主要在于发现得太晚，一旦发现就难以治愈，这样给人们造成了极大的恐惧。,积极的做法应当是设法认识肿瘤，不要让它出现太早，尽量延缓其出现和生长，有效地控制它。,肿瘤基因诊断的内容,基础：肿瘤发病分子机制深入探索,临床：,早期及预警诊断,易感性评估及监测,肿瘤的鉴别、分级、分期及预后,辅助治疗方案确定,疗效监测及评估,策略一：易位染色体和融合基因检测,如T细胞受体基因TCR与IgH重排后，原先间隔数百bp的V区和J区靠近，通过扩增片段长度判断是否重排,策略二：癌基因和抑癌基因检测,如原癌基因K-ras第12、13和61位密码子点突变：GGT-TGT/GTT/GAT/GCT；,抑癌基因p53密码子130290之间的基因突变,策略三：病毒癌基因检测,多种DNA或RNA病毒感染与肿瘤相关,策略四：肿瘤标志物检测,tumor marker:肿瘤组织产生的、与肿瘤发生发展相关的物质，如肿瘤抗原、激素、酶等。,基因治疗分类,体细胞,(somatic cell),基因治疗,生殖细胞,(,germline,),基因治疗,只限于某一体细胞的基因的改变,只限于某个体的当代,对缺陷的生殖细胞进行矫正,当代及子代,第三节 基因治疗,一、基因治疗的策略,二、基因转移技术,四、治疗基因的受控表达,三、基因干预,五、基因治疗的应用研究,一、基因治疗的策略,基因治疗的概念,定义：将目的基因导入靶细胞内，成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因表达产物对疾病起治疗作用。,（一）基因置换（gene replacement）,定义：,指将特定的目的基因导入特定细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。,目的,：将缺陷基因的异常序列进行桥正。,对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。,又称为基因打靶(,gene targeting,）,定点整合的条件:转导基因的载体与染色体上的,DNA,具有相同的序列。带有目的基因的载体就能找到同源重组的位点，进行部分基因序列的交换，使基因置换这一治疗策略得以实现。,基因同源重组技术,要实现基因置换，需要采用同源重组技术使相应的正常基因,定向,导入受体细胞的基因缺陷部位。,定向,导入的发生率约1/100万，采用胚胎干细胞培养的方法，这种同源重组的检出率最高可达1/10。,（二）基因添加,基因添加或称基因增补,（gene augmentation）:,通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。,类型:,在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，而细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；,向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。,（三）基因干预,基因干预,（gene interference）:,采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。,（四）自杀基因治疗,自杀基因治疗:恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。,原理:将“自杀”基因导入宿主细胞中，这种基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导靶细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。,自杀基因的作用机制,TK/GCV,单纯疱疹病毒（herps simplex virus,HSV,）型胸苷激酶（thymidine kinase,tk,）基因编码胸苷激酶，特异性地将无毒的核苷类似物丙氧鸟苷（ganciclovir,GCV,）转变成毒性GCV三磷酸核苷，后者能抑制DNA聚合酶活性，导致细胞死亡。,CD/5-FC,大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（cytosine deaminase,CD,）基因，在细胞内将无毒性5-氟胞嘧啶（,5-FC,）转变成毒性产物5-氟尿嘧啶（,5-FU,）。,1.自杀基因系统,旁观者效应,:“自杀基因”治疗不仅使转导了“自杀基因”的肿瘤细胞在用药后被杀死，而且与其相邻的未转导“自杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。,2.旁观者效应,（五）基因免疫治疗,通过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。,二、基因转移技术,The Technique of Gene Transfer,基因治疗的两种途径,载体,目的基因,in vivo,ex vivo,靶细胞,基因转移(gene transfer)技术：,1.病毒介导的基因转移系统。,2.非病毒介导的基因转移系统,。,1.病毒介导的基因转移系统,病毒载体,介导的基因转移效率较高，因此它也是使用最多的基因治疗载体。据统计，有72%的临床实验计划和71%的病例使用了病毒载体，其中用得最多的是逆转录病毒载体。,2.非病毒载体介导的基因转移系统,（1）脂质体介导的基因转移技术,脂质体介导的基因转移技术使用方便、成本低廉。,基本原理,:利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。,脂质体介导的基因转移示意图,（2）受体介导转移技术,将DNA与细胞或组织亲和性的配体偶联，可使DNA具有靶向性。这种偶联通常通过多聚阳离子（如多聚赖氨酸）来实现。多聚阳离子与配体共价连接后，又通过电荷相互作用与带负电荷的DNA结合，将DNA包围，只留下配体暴露于表面。这样形成的复合物可被带有特异性受体的靶细胞吞饮，从而将外源DNA导入靶细胞。,受体介导转移技术示意图,（3）基因直接注射技术,不需要进行基因工程的繁琐操作，直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。,动物实验表明：接受注射外源DNA的小鼠能够按其基因编码合成相应的蛋白质，并能维持数月之久。,1.将促进心脏血管生长的基因直接注入实验鼠的心脏，可使其心脏壁内毛细血管增加30%40%；,2.将胰岛素基因直接注入鼠骨骼肌细胞，能分泌糖尿病所缺少的胰岛素；,3.肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需的凝血因子等等。,基因直接注射法的优点,1.制备具有调控部件的质粒DNA重组体的技术较容易；,2.排除病毒载体可能潜在的致癌性或其他副作用；,3.导入的基因不需整合即可表达，避免了逆转录病毒载体导入整合后，一旦发生副作用不易中止或逆转的缺点；,4.基因直接注射法可反复使用，而病毒载体则可能诱导体内免疫应答，致使反复治疗效果下降。,基因干预,1.反义RNA(antisense RNA),2.干扰RNA(RNA interference),3.核酶,(ribozyme),（一）反义RNA,1.反义RNA与基因表达调控,利用反义RNA对体外培养的细胞进行基因表达调控，通常采用的方法有两种：,（1）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，细胞吸收RNA后，发挥作用。,（2）构建能转录反义RNA的重组质粒，将质粒转入细胞，转录出反义RNA而发挥作用。,2.受体介导反义RNA技转移术,受体介导的RNA转移十分专一，而且效率高；,被转移的RNA是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层,可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。,将,脱唾液酸血清类粘蛋白,（ASGP）与多聚赖氨酸（PL）共价连接，得到ASGP-PL复合物，成为运载核酸的工具。ASGP-PL反义RNA复合物可以专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并吞噬到肝细胞中，反义RNA进入肝细胞后，可被逐渐释放出来发挥作用。,借助受体介导DNA转移方法把DNA换成反义RNA，就可以实现受体介导的反义RNA的转移。,3.反义RNA的应用前景,受体介导的反义RNA基因治疗有其自身的优点，而在,一定程度上补充了转基因治疗的不足。,（l）安全性高,（2）反义RNA设计和制备方便,（3）具有剂量调节效应,（4）能直接作用于一些RNA病毒,反义RNA只作用于特异的mRNA分子，不改变所调节基因的结构。反义RNA分子无论怎样修饰，最终将在细胞内部被降解，不留“残渣”。,在治疗RNA病毒感染性疾病时，受体介导的反义RNA基因治疗比一般的DNA基因治疗有更大的优势。利用反义RNA可以直接作用于病毒RNA，阻断RNA病毒的繁殖。,（二）干扰RNA,实验结果显示，有义链RNA（sense RNA）或反义链RNA（antisense RNA）均能抑制线虫基因的表达，双链RNA比单链RNA更为有效。将特异的双链RNA注入线虫体内可抑制有同源序列的基因的表达。得到的结果是有义链RNA和反义链RNA都同样阻断基因表达途径。这与传统上对反义RNA技术的解释正好相反。而且其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。,1.RNA干扰现象,RNA干扰,（RNA interference，RNAi）,是一种由双链RNA诱发的基因沉默现象。在此过程中，与双链RNA有同源序列的信使RNA（mRNA）被降解，从而抑制该基因的表达。,对RNA干扰的认识来源于用线虫（C.elegans）和果蝇所进行的实验。,1.体外化学合成;,2.用质粒载体或病毒载体可在细胞内稳定地生成。,siRNA的产生,2.RNA干扰的应用前景,RNA干扰研究目前已经在功能基因组学研究、微生物学研究、基因治疗和信号转导等广泛领域取得了令人瞩目的进展，使其在医学、生物学领域的应用有着广阔的前景。,（1）研究基因功能的新工具,由于 RNA干扰技术具有高度的序列专一性和有效的干扰能力，可以使特定基因沉默或功能丧失，因此可以作为功能基因组学的一种强有力的研究工具。,RNA干扰技术能够在哺乳动物中抑制特定基因的表达，建立多种表型；抑制基因表达的时间可以控制在发育的任何阶段，,产生类似基因敲除的效应,。,（2）肿瘤的基因治疗,传统反义RNA技术诱发的单一癌基因的阻断，不可能完全抑制或逆转肿瘤的生长，而,RNA干扰技术可以利用同一基因家族的多个基因具有一段同源性很高的保守序列这一特性,，设计针对这一区段序列的双链RNA分子，只使用一种双链RNA即可以产生多个基因同时剔除的表型，也可以同时使用多种双链RNA而将多个序列不相关的基因同时剔除。RNA干扰技术可用于治疗有异常基因表达的恶性肿瘤。,K-RAS蛋白为肿瘤发生所必需，bcr/ab1融合基因与人白血病有关，用RNA干扰技术可以阻碍K-RAS蛋白的表达从而抑制肿瘤发生，或杀死有bcr/ab1的人白血病细胞系。,通过RNA干扰抑制某些内源性基因的表达，能促进白血病细胞系的细胞凋亡或增加其对化疗药物的反应性。,应用RNA干扰技术成功地阻断了MCF-7乳腺癌细胞中一种异常表达的与细胞增殖分化相关的核转录因子基因Sp1的功能。,（3）病毒性疾病的基因治疗,RNA干扰可以被看成是一种与免疫系统类似的防御机制。用siRNA抑制人类免疫缺陷病毒（HIV）某些基因的表达，如P24、Vif、nef、tat或rev，,阻碍HIV在细胞内复制,。用RNA干扰技术抑制HIV的受体（CD4）或辅助受体（CXCR4或CCR5）在细胞内表达，可,阻碍HIV感染细胞,。也可通过RNA干扰抑制其他病毒在细胞内复制，如脊髓灰质炎病毒、人乳头状瘤病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒等。,（三）核酶,(ribozyme),天然核酶多为单一的RNA分子，具有自我剪切作,用。但核酶也可以由两个RNA分子组成。,在基因治疗时，利用核酶分子结合到靶RNA分子中适当的邻位，形成锤头核酶结构，将靶RNA分子切断，通过破坏靶RNA分子达到治疗疾病（如清除病毒基因组RNA）的目的。,只要两个RNA分子通过互补序列相结合，形成锤头状的二级结构（3个螺旋区），并能组成核酶的核心序列（13个或11个保守核苷酸序列），就可在锤头右上方产生剪切反应。,核酶的作用机制,2.核酶的应用,与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。,谢谢,