核素标记化合物-检验核医学.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,放射性核素标记化合物,第一节 概述,一、放射性核素标记化合物定义,二、放射性核素的来源,三、常用概念,一、放射性核素标记化合物,标记化合物(,labeledcompound),凡是分子中某一原子或多个原子或其化学基团被其易辨识的同位素或其他易辨识的放射性核素所取代，而成为一类易被识别的化合物，则称之为标记化合物。被放射性核素取代的化合物称为放射性核素标记化合物。这种取代过程称为,标记（,label）,二、放射性核素的来源,1.反应堆生产放射性核素,2.加速器生产放射性核素,3.从放射性核素发生器得到,反应堆,2、加速器原理,3、放射性核素发生器,是一种能从较长半衰期的放,射性母体核素中分离出由它,衰变而产生的较短半衰期的,放射性子体核素的装置。,三、几个基本概念,一、放射性浓度、放射性纯度、放射化学,纯度和放射性比活度、,二、同位素标记与非同位素标记,三、定位标记与非定位标记,一、,放射性浓度、放射化学纯度和放射性比活度,2,、放射化学纯度,放射化学纯度(,radiochemicalpurity，RCP,）：,在一种放射性核素产品中,以某种特定化学形态存在的这种放射性核素的百分含量。,二、同位素标记与非同位素标记,化合物中的原子被其同位素原子取代，称为同位素标记（,isotopic labelling），,由于标记化合物的化学、物理、生物学性质不会引起显著差异，亦称理想标记，如,13,N-NH,3,，,15,O-H,2,O,用化合物组成以外的原子标记，称非同位素标记(,nonisotopic labelling)，,又称非理想标记，如,131,I-AFP（,甲胎蛋白），,99,Tc,m,DTPA,三、定位标记与非定位标记,定位标记（,specific labeling）：,分子中的标记原子限定在指定的位置上，用“,S”,表示。如：,S-5-T-,尿嘧啶，其中95%以上,3,H,标记在尿嘧啶分子的第五位碳原子的,C-H,键上。,非定位标记（,non-specific labeling）：,标记原子的结合部位无法确定，称之为非定位标记。,双标记（,double,labelling,)：,在化合物不同部位引入两种不同示踪核素称之为双标记，该化合物称为双标记化合物。,均匀标记、全标记,（一）、化学合成法,（二）、生物合成法,（三）、同位素交换法,（四）、金属络合物法,（五）、其他标记方法,一、放射性核素标记化合物的制备方法,二、,14,C、,3,H、,32,P、,35,S,等标记化合物的制备,略,三、放射性碘标记化合物,的制备,（一）、同位素交换法,（略）,（二）、蛋白质、多肽的碘标记,（三）、核酸的碘标记,（简）,蛋白质、多肽的碘标记,一、常见的标记方法,（一）蛋白质、多肽碘标记的原则：,1、待标记物要有可被碘原子结合的基团。,2、要将,Na,*,I,中的,*,I,-,离子氧化成,*,I,0,或,*,I,+,OH,*,I,CH,2,CHCOOH,NH,2,酪氨酸,N,HN,*,I,CH,2,CHCOOH,NH,2,组氨酸,NH,CH,2,CHCOOH,NH,2,*,I,色氨酸,*,I,1、直接标记法,（1）,氯胺-,T,法,（2）乳过氧化物酶法,（3）Iodogen,法,2、间接标记法,蛋白质、多肽的碘标记,（二）常用的标记方法,A、,方法学原理：,氯胺-,T（Chloramine T,Ch-T）,化学名称：,N-,氯代对甲苯磺酰胺钠盐，是一种温和的氧化剂，在水中形成次氯酸，将阴离子的,I,-,氧化为分子态的,I,0,或,I,+,，,在弱碱性（,pH7.5）,的环境里能与蛋白质或多肽的酪氨酸残基苯环上的,H+,发生置换反应，制得碘标记物。,蛋白质、多肽的碘标记,（1）氨胺-,T,法(,Ch-T),B、,Ch-T,标记实例,（放射性,AFP,的制备）,5、向管中加入新鲜配制的偏重亚硫酸钠（,Na,2,S,2,O,5,）,水溶液20,ul20ug），,充分混匀，中止反应,2、再向管中加入50,mmol/L,的,PB（pH7.5,）25,ul,3、向管中加入无载体,Na,125,I,溶液37,MBq（2ul）,4、向管中加入用,PB,新鲜配制的氯胺-,T 10ug,（10ul）,立即充分混匀，室温反应60秒左右,1、向1.5,ml,锥形离心管中加入含,AFP（5ug）,的,50,mmol/L,的,PB（,磷酸盐缓冲液）5,ul,6、加入,KI 100ug,标记物立即进行分离纯化，并进 行薄板层析，计算碘标记率、,125,I-AFP,的比活度、放射化学纯度.,蛋白质、多肽的碘标记,蛋白质、多肽的碘标记,C、Ch-T,标记注意事项,1、氧化剂与还原剂,Ch-T,和,Na,2,S,2,O,5,遇水、空气、阳光都不稳定，应新鲜配制，1小时内应用。,Ch-T,用量应适当，过多易损伤标记物的生物活性，过少则标记率降低或标不上，理论上37,mBq,的*,I,仅需0.08,ug，,实际用量比理论高，一般通过预实验确定。,Na,2,S,2,O,5,用于还原,Ch-T,以终止碘化反应，用量往往是,Ch-T,的1.5-2倍。,2、反应体系的,pH,一般最佳,pH,在7-8之间，过低过高均影响标记率。为保证反应体系足够的缓冲容量，常用50 500,mmol/L,的,PB。,3、反应体积,待标记物和*,I,的化学量极少，反应体积不宜过大，过大使反应物浓度变小，影响标记率，一般体积在50-500,ul。,4、温度与反应时间,室温下，反应时间控制在1分钟左右。过短，标记率低；过长，虽然标记率高，但易损伤标记物生物活性。温度降低可适当延长反应时间。,5、放射性,*,I,的选择,应选择新鲜、比活度高、无还原剂的*,I，,放射性浓度在1.85-37,GBq/ml,为宜。,（2）乳过氧化物酶法,（,Lactoperoxidase，LPO）,A,方法学原理,以,LPO,为催化剂和微量,H,2,O,2,作用，释放出新生态氧，从而将离子碘（,I,-,）,氧化成单质碘（,I,0,）,，由此标记在蛋白或多肽中酪氨酸残基，也称之为酶促标记。,蛋白质、多肽的碘标记,（3）,Iodogen,法,A Iodogen,法原理,Iodogen（1，3，4，6-,四氯-3,，6 ,二苯基甘脲，,1，3，4，6-Tetrachloro,-3,，6 diphenlglycoluril,），简称氯苷脲，是一氧化剂，引起碘化反应的机制与,Ch-T,相似。但其不溶于水，可溶于二氯甲烷、三氯甲烷、二甲亚砜等有机溶剂。将其溶于有机溶剂，然后涂到反应管内壁，加入配好的待标记蛋白多肽和*,I,后，混匀即可进行标记，将反应液取出或稀释即可终止反应。,蛋白质、多肽的碘标记,2、,间接标记法,又称联接标记，用于标记分子上不含酪氨酸、组氨酸或色氨酸残基，或该残基位于分子的活性基团上，直接标记后影响分子生物活性的蛋白质或多肽。,先将放射性碘标记在一个较为活泼的载体分子上（如,Bolton-Huntor,试剂），然后再将这个小分子蛋白质或多肽结合，完成标记。,蛋白质、多肽的碘标记,间接标记法特点,避免了蛋白质和氧化剂直接接触，防止在碘标记过程中氧化剂对标记分子的损伤；,需经二步标记，碘的利用率及标记率均很低；,标记时需引入一个较大的联接剂，对小分子的肽类的生物活性有影响，不适于,MW 10000,的小肽。,蛋白质、多肽的碘标记,（三）,、核酸的碘标记,核酸是重要的生物大分子，其放射性碘化标记是将放射性碘标记到构成单元的碱基上，如尿嘧啶和胞嘧啶的嘧啶环上。方法：先将,DNA,加热到70，使之解析成单股的,DNA，,再用氧化剂（三氯化铊、浓,HNO,3,）,将离子碘（,I-）,氧化成单质碘，后者与嘧啶环上的第五位碳原子呈共价键结合，从而达到标记,DNA,的目的。,四、,99,m,Tc,标记化合物的制备,略,第三节、放射标记化合物的纯化、质量鉴定、辐射自分解和贮存,一、放射标记化合物的纯化方法,必要性,标记化合物在标记过程中引入了,一些成份；,标记化合物本身不稳定,。,指标,放射性纯度、放射化学纯度等,。,（一）纯化方法,可用各种分离方法，如萃取、沉淀、蒸馏法等。,医学上常用层析法、色谱法、透析法和电泳法分离。,1、层析法,（1）纸层析,（2）柱层析,凝胶柱层析,离子交换层析,亲和层析,纸层析原理,比移植（,Rf）=b/c,二、质量鉴定,包括物理鉴定、化学鉴定和生物鉴定。,物理鉴定,：,外观、放射性活度和比活度，放射性纯度等；用谱仪、活度计等,化学鉴定：,放射化学纯度，化学纯度、载体含量、酸度等；高压液相色谱、纸层析、分光光度计等,生物鉴定：,细菌、热原、生物毒性和生物活性等。细菌培养、鲎试验、家兔热原试验、动物实验等,三、辐射自分解,1、定义,2、机理,3、方式,辐射自分解(,autoradiolysis)：,由于,放射性核素电离辐射的作用，致使标记化合物本身产生电离、激发或化学键断裂，或者作用于相邻的分子，使其激活物质，例如产生自由基等，这种现象称为,辐射自分解。,1、定义,核素自身的衰变和射线能量在标记化合物及其邻近分子上的转移所导致分子内化学键的断裂，并由此产生的一系列物质化学形态和性质的改变。这种能量的转移常表现在分子的激活、键断裂和自由基的产生，并能增加有机化合物的氧化、水解和岐化等。,2、机理,初级内分解：,指标记核素本身的衰变。,初级外分解：,指标记核素发出的射线直接作用于标记化合物分子，使其电离、激发或化学键断裂。,次级分解：,射线首先作用于标记化合物邻近的分子使其激活物质或自由基，它们再使标记化合物分解。,3、辐射自分解的方式,四、放射性核素标记合物的贮存,（一）,、影响辐射自分解的因素,（二）、,控制辐射自分解的方法,（三）、,常用标记化合物的贮存,（一）,影响辐射自分解的因素,1、与标记化合物吸收射线能量的,效率有关,2、,与标记化合物的比活度有关,3、与标记化合物的纯度有关,（二）,控制辐射自分解的方法,1、控制标记化合物的比活度在适当的水平,2、选择适当的溶剂,溶剂的要求：,1）具有优良的耐辐射性能,2）,能够溶解标记物,3）应经蒸馏纯化,3、加入自由基清除剂,4、降低贮存温度,思考题,1,、蛋白质、多肽碘标记的原理是什么？,2,、常用的蛋白质、多肽碘标记的方法有？,3,、何谓辐射自分解？,4,、如何控制辐射自分解？,