第十一章--核酸的生物合成.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三篇 遗传信息的传递,第十一章 核酸的生物合成,1,、生物遗传信息的中心法则（复制、转录和翻译等）。,2,、,DNA,复制有关的酶以及各自作用，,DNA,的复制的特点以及复制的过程，掌握,3,、,DNA,的损伤与修复。,4,、,RNA,的生物合成（,RNA,聚合酶的组成、种类与性质）。,5,、,RNA,的转录后加工。（尤其是各种,RNA,的加工）。,6,、,RNA,指导下的,RNA,和,DNA,的生物合成（尤其是逆转录）。,7,、比较,DNA,与,RNA,生物合成的相同点和不同点。,要求掌握：,1,、基因,DNA,大分子上的各个功能片段，有,复制、转录等功能。,2,、分子生物学中心法则及其补充。,DNA,RNA,蛋白质,转 录,翻 译,复 制,反 转 录,RNA,翻 译,蛋白质,复 制,3,、基因表达,通过转录和翻译、用基因的遗传信,息在细胞内合成有功能意义的各种蛋白质。,由于中心法则的建立，人们对核酸、蛋白质的研究,更深入了，不仅研究它们的结构、功能、相互作用以,及它们之间一套复杂、精确的调控机制、调控基因的,表达与不表达；而且在体外可对,DNA,进行改造，使遗,传性状改变或有目的地使基因表达产生蛋白质等基因,工程的应用。现今，人们把研究蛋白质、核酸等生物,大分子的结构、功能以及它们之间相互作用的科学划,分为又一门新的学科，即分子生物学。,随着分子生物学的进一步研究，将来对中心,法则可能还会作出进一步补充。如,RNA,在中心,法则中只是参与遗传信息的表达，但在补充法,则却作为遗传物质；最近发现某些,RNA,分子具,有酶活性。最近，有学者提出：,RNA,不单是沟,通“,DNA,蛋白质”之间的桥梁。,RNA,可能是功,能比,DNA,更广泛的信息分子、可能是生命起源,过程中最早出现的生物大分子。,本篇依中心法则将介绍复制、转录、翻译。同时介绍基因调控和基因工程这两个在生命科学中处于理论和应用的最前沿课程。,一、,DNA,复制方式,1,、,DNA,复制模式,半保留复制,（1）,复制,以亲代,DNA,为模板，以四种,dNTP,为原料，按碱基配对原则（,A=T，G,C）,合成子代,DNA,的过程。,（2）,DNA,复制的特点之一：半保留复制,第一节,DNA,的生物合成,半保留复制,DNA,复制时，亲代,DNA,的两条链都作为模板，各自指导合成互补链，形成两个与亲代,DNA,完全一样的子代分子，在每个子代,DNA,分子中均保留了一条亲代,DNA,链，,DNA,这种复制方式被称为半保留复制。,原核生物总是从一个固定的起始点开始，在两条模板上同时向两个（相反）方向进行，称双向复制。,真核生物,双向复制；多点复制（有多个复制起始点，同时形成多个复制单位）。,单向复制模式和双向复制模式,复制泡,二、复制点（,DNA,复制的起始点和方向）,三、,DNA,聚合反应有关的酶及相关蛋白因子,1）引发酶作用在模板的复制起始部位催化互补碱基的聚合，形成短片段,RNA,引物。其本质为：,RNA,聚合酶（是一种不同于,DDRP,的,RNA,聚合酶）。,2）引发体为解链酶与其他复制因子结合辨认起始点时再结合引物酶形成引发体。引发体,解链酶+其它复制因子+引发酶,故引发体的作用是：辩认起始点，结合在,DNA,模板上，解开,DNA,双链，催化,RNA,引物形成。,3）引物为什么是,RNA,而不是,DNA,依赖于,DNA,模板的,DNA,聚合酶简称,DDDP,，不能催化两个游离的,dNTP,聚合，而,RNA,聚合酶能催化两个游离的,NTP,聚合。,1,、,RNA,引物合成酶（引发酶）,2,、,DNA,聚合酶,催化5,3,的聚合反应：在引物上3,-,OH,未端逐个加入,dNMP（,由,dNTP,去除,PPi,生成），使新链不断延长。反应需：,模板，按,A=T，G,C,合成新链。,引物，引物3,-,OH,和下一个,dNMP,在聚,合酶催化下生成3,5,-,磷酸二酯键，通过3,5,-,磷酸二酯键将单个核苷酸连 成长链。,合成方向5,3,，,模板阅读方向3,5,。,3,、,DNA,连接酶,1,作用：连接,DNA,链,3,-,OH,未端和另,一,DNA,链的,5,-,P,未端，使二者生成磷酸,二酯键。如连接冈崎片段，,DNA,修复、,重组、剪接中起缺口缝合等。,2,注意：连接酶连接的都是碱基互补基础上的双链中的单链缺口，不能连接单独存在,的,DNA,或,RNA,单链作用。,4,、解旋、解链酶类,解开“超螺旋”，解开并理顺模板,DNA,双链，,与,SSB,配合维持（模板部位）单链状态。,解链酶：,作用：解开,DNA,双链。解链酶有两种，一是,rep,蛋白（解链酶,I,），沿模板,3,5,移动。二是解链酶,II,，沿模板,5,3,移,动。,5,、单链,DNA,结合蛋白（,single stranded,DNA-binding Protein,，,SSB,或,DBP,），,曾称螺旋反稳定蛋白（,HDP,）,作用：,与解开的单链,DNA,结合，维持复制时模,板处于单链状态，防止复性。,对抗核酸酶水解单链,DNA,，保护单链,完整性。,SSB,可结合跨度为,32,个核苷酸单位，在,DNA,解链中不断结合，脱离再结合。,6,、,DNA,拓扑异构酶（拓扑酶）,作用：松驰超螺旋，克服解链中出现的打结缠绕、,连环现象。,拓扑酶广泛存在于真核细胞及原核细胞，可分为两型：,1I,型拓扑酶：切断双链,DNA,中的一段，待,DNA,松,弛后可将切口接上。不需,ATP,。,2II,型拓扑酶：有双重作用,水解作用,切断双链,DNA,某部位，松弛超螺旋。,（不需,ATP,）,接合作用,DNA,松弛解缠后，连接断口，并使,DNA,进入负螺旋状态（右旋；“负”,比“正”有更好的模板作用）。,（消耗,ATP,）,DNA,的复制过程,1,、起始,1）,辩认起始部位：由解链酶在,DnaB,起始蛋白协助下结合于复制起始点上。,2）解开,DNA,双链：在起始点进行，解链酶解开,DNA,双链。需,ATP（2ATP/bp）,。,3）拓扑酶（主要为,II,型）松解超螺旋，防止由于解链出现的下游打结及缠绕现象。,4）SSB,（单链,DNA,结合蛋白）结合于开放的单链上，稳定和保护单链作用,5）引发体中的引发酶按碱基配对规律合成,RNA,引物。（以,DNA,为模板按5,3,方向合成。引物约含十几几十个碱基、有3,-,OH,未端的,RNA,片段）。,6）,pol III,的亚单位辩认引物。第一个脱氧核苷酸在该酶催化下加到引物3-,OH,未端上，形成磷酸二酯键。,复制叉形成,复制叉无论原核或真核细胞，复制开始由于,DNA,双链解开，在两股单链上同时进行复制，在电镜下均看到伸展成叉状的复制现象。在引物生成后，复制叉的形状已基本具备。,复制的速度：细菌复制速度很快，2500,bp/s，20,分钟可繁殖一代。真核生物复制速度慢些，但因其有多个复制始点，故总速度与原核差不多。,2,、复制的延长,由,DNA,聚合酶（原核,pol III；,真核,DNA,聚合酶,）催化,dNTP,以,DNA,为模板，按碱基配对原则逐个加到新链中，链得以延长，新链合成方向5,3,。,复制的速度：,细菌复制速度很快，2500,bp/s，20,分钟可繁殖一代。,真核生物复制速度慢些，但因其有多个复制始点，故总速度与原核差不多。,Eukaryotic,真核生物,DNA replication,Prokaryote,原核生物,DNA replication,（,2,）前导链和滞后链的合成,DNA,双链走向相反，模板方向为3,5,，,而复制方向5,3,。,1）,前导链：一股新链其模板解链方向与复制方向一致，可以连续合成，称为,Leading strand,前导链,；,2）,滞后链：另一股链其复制方向与解链方向相反，不能连续合成，称为,Lagging strand,滞后链,。,3、复制的终止,1）引物水解。由一种,RNase,将领头链及冈崎片,段的引物水解除去。,2）修补空缺（引物水解后留下的空缺）。,由,DNA,聚合酶,催化（原核,pol I;,真核,DNA,聚合酶,）；,修补方向也是53。,3）连接。由,DNA,连接酶催化。,连接,冈崎片段；,连接领头链的主体与引物空缺修补小片段。,1,、原核细胞,DNA,的复制,（,1,）复制所需的条件（或称“复制体系”）：,1）底物：,d NTP,2）,聚合酶：,DNA,聚合酶,3）模板：模板,DNA,的双链（即解开为单链状态的两,条,DNA,母链）,4）引物：,DNA,聚合酶不能催化两个游离的,dNTP,互相聚合，需一引物。引物即为小分子,RNA（,含3,-,OH,的寡核苷酸）。,5）其他酶和蛋白质因子。如解旋酶、解链酶、,DNA,连接酶等。,三、原核生物中,DNA,的复制,（,2,）原核生物的,DNA,聚合酶为三种：,pol I pol II pol III,含量 最多 最少,活性 见课本 见课本 见课本,功用 校读、修复 复制 复制最主要的酶,填补空缺,核酸外切酶活性,5,3,+,3,5,+,核酸外切酶活性。,15,3,外切酶活性：从,5,端把核苷,酸从核酸链上水解下来，,pol I,、,III,具有。,23,5,外切酶活性：从,3,端把核苷,酸从核酸链上水解下来，,pol I,、,II,、,III,均具有。,核酸外切酶活性的作用是：,即时校读,DNA,复制出现碱基配对错误,时，,DNA,聚合酶利用外切酶活性（主要,为,3,5,外切酶）清除错配碱基，并利,用,5,3,聚合酶活性补回正确配对碱基，,这种功能称之。主要由,pol I,完成。,切除引物、切除突变的片段,均为,pol I,5,3,外切酶的作用。,复制的保真性（,fidelity,）,1,、概念,DNA,复制时,DNA,聚合酶依赖模,板，保证遗传信息传代延续中子链与母链,配对准确无误，称之。,2,、保真机理,1,遵守严格的碱基配对规律。聚合时，磷,酸二酯键的形成应在氢键的准确搭配之,后发生。,2,聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能。,如母链为,T,，酶能选择,A,而不是其他。,3,复制中出错时有即时校读功能（有错即改）。,原核生物,DNA,的复制过程：,辩认起始部位：由解链酶在识别蛋白协助下结合于复制起始点上。,解开,DNA,双链：在起始点进行。,解链酶解开,DNA,双链。需,ATP,解开双链并非解链酶单独作用,（2ATP/bp）,，可能构成引发体后再进行解链。,DNA,旋转酶或拓扑酶（主要为,II,型）松解超螺旋，防止由 于解链出现的下游打结及缠绕现象。,单链结合蛋白,SSB,结合于开放的单链上，稳定和保护单链作用,引发体中的引发酶按碱基配对规律合成,RNA,引物。以,DNA,为模板按53方向合成。引物约含十几几十个碱基、有3-,OH,未端。,pol III,的亚单位辩认引物。第一个脱氧核 苷酸在该酶催化下加到引物3-,OH,未端上，形成磷酸二酯键。,四、真核生物中的,DNA,复制,真核生物的,DNA,聚合酶为五种：,1,）,DNA,聚合酶,and,主要复制,染色体,DNA,DNA,聚合酶,主要为滞后链的合成；,DNA,聚合酶,主要为前导链的合成,2,）,DNA,聚合酶,and,主要为修复,DNA,3,）,DNA,聚合酶,主要线粒体,DNA,复制和修复,.,端粒与端粒酶,端粒：是真核细胞染色体末端一种膨大的、,DNA,富含,GC,重复序列的粒体结构。,端粒酶：是一种由,RNA,和蛋白质组成的能催化,DNA,合成的酶。这种合成以本身的,RNA,为模板。,模板,AGGGTTAC,新链 5,CCCAAUG (RNA,片断),端粒酶,端粒,DNA polymerase,3,）在真核细胞，,DNA,复制的同时，各种染色体蛋白（组蛋白及非组蛋白）同时合成。一但,DNA,复制结束，即可装配为核蛋白并组成染色体。,五、反转录作用（,RNA,指导的,DNA,合成）,DNA RNA,转录,逆转录,RNA,转录,反转录主要从病毒中发现,RNA,指导的,DNA,聚合酶、其催化底物为,d NTP，,催化生成与,RNA（,作为模板）碱基序列互补的,DNA；,遗传信息从,RNA,流向,DNA。,一,DNA,突变,突变的概念：由于理化因素使,DNA,组成改变，即,DNA,分子上的碱基改变，如未能完全修复而引起可遗传的变异称之。又称基因突变。,突变的原因有：自发突变和诱变：自发突变即遗传过程“自发”地发生；诱变即用人工手段（理化因素：如紫外线、离子辐射、羟胺、亚硝酸盐、氮芥类等。），使,DNA,发生突变,。,第二节,DNA,的损伤与修复,（二突变的结果,包括：,致死性；,生物体内某些功能丧失；,只改变基因而对表现型无影响；,产生了利于物种生存或有利于人类的结果。,三突变的类型：,1、点突变：,DNA,分子上一个碱基的变异。又分为转换,和颠换：转换即同型碱基的转换；颠换即异型碱基,（嘌呤与嘧啶）的转换。,2、缺失：一个碱基或一段核苷酸链从,DNA,上消失。,3、插入:一个碱基或一段核苷酸链插入到另一个,DNA,分子上，缺失和插入均引起移码突变（转录后密码,子改变）。,4、倒位：,DNA,链内部重组。其中一段方向反置，如从,5,3,变为3,5,或一大段,DNA,分子在,DNA,分,子内迁移。,GA,A,GTAGCT GA,G,GTAGCT,为点,转换,突变,GAC,C,TAGCT GAC,T,TAGCT,为 为点,颠换,突变,GA,CG,TAGCT GATAGCT,为 为,缺失,突变,GACGTAGCT GACG,CA,TAGCT,为,插入,突变,GAC,GTAG,CT GAC,GATG,CT,为,倒位,突变,复制过程中发生,DNA,突变称为,DNA,损伤，,大多属于自发突变。体内靠校读和修复机制消,除已发生的缺陷。,1、校读：,核内,pol I,有核酸外切酶活性，随时把错误配,对的核苷酸切除，并利用其,DNA,聚合酶活性补,回正确的核苷酸。这种由,pol I,监视和纠正复制,错误的功能称校读。,二、损伤的修复,2、修复：,如错误配对屡屡发生或涉及范围大，则需,一些机制来修复，包括：,（1）、光修复：需光能激活的修复酶修复。如该 酶可使因紫外线照射而形成的二聚体,T T,分解为原来的单体状态。,（2）、切除修复：需特异核酸内切酶、,pol I、DNA,连接酶的共同作用。,这是人类,DNA,损伤的主要修复方式。,3、重组修复：适于损伤面积较大时。,4、,SOS,修复：紧急修复，出现的错误多且广泛。由于修复不完全，可引起较长期广泛的突变。,转录（,DNA,指导下的,RNA,合成）,1,、转录,生物体以,DNA,为模板，按碱基互补规律合成,RNA,的过程。把,DNA,的碱基序列抄录成,RNA,的碱基序列。,2,、转录所需的条件：,1,原料：,NTP,2,模板：,DNA,双链中的一股,3,酶：,RNA,聚合酶，全称为“依赖,DNA,的,RNA,聚合酶”（,DNA-dependent RNA polymerase DDRP,），也称转录酶。,第三节,RNA,的生物合成,一、概述,一,原核生物的,RNA,聚合酶（以,E.coli,的酶研,究比较透彻）,1,、该酶由,5,个亚基组成：即,2,，,其,中,亚基易脱落。,2,、核心酶：即,2,，具有催化聚合功能，,不能辩认起始点，但参与转录的延长。,一、,RNA,聚合酶,3,、全酶；即,2,，既辩认转录起始点，,又有催化聚合功能，参与转录起始。,4,、各亚基的功能：,亚基,决定哪些基因被转录,亚基,与转录全过程有关,亚基,结合,DNA,模板,亚基,辩认起始点。,亚基本身并无催化功能,;,它的作用是识别,DNA,分子上的起始信号。,有三种类型：,RNA pol I,、,RNA pol II,、,RNA pol III,。,RNA pol I,转录产物为,rRNA,的前体（,45S-rRNA,）；,RNA pol II,转录,mRNAD,的前体（,hnRNA,）；,RNA pol III,转录,5S-rRNA,，,tRNA,，,snRNA,（核,RNA),前体。,由于,hnRNA,为,mRNA,前体，而,mRNA,在各种,RNA,中寿命最短，最不稳定，需经常合成，故酶,II,被认为是最重要的酶。,（二）真核,RNA,聚合酶,1,、启动子是,DNA,分子可以与,RNA,聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。在基因表达的调控中，转录的起始是个关键。常常某个基因是否应当表达决定于在特定的启动子起始过程。,2,、启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与,RNA,聚合酶结合。,3,、在,RNA,合成开始位点的上游大约,10bp,和,35bp,处有两个共同的顺序，称为,-10,和,-35,序列。,这两个序列的共同顺序如下：,-35,区“,AATGTGTGGAAT”,；,-10,区“,TTGACATATATT”,。大多数启动子均有共同顺序只有少数几个核苷酸的差别。,4,、启动子中的,10,和,-35,序列是,RNA,聚合酶所结合和作用必需的顺序。,二、启动子,三、终止子,-10,序列又称为,Pribnow,盒,(,原核生物,),。在真核生物中相应的序列位于,-35bp,处，称为,TATA,盒，又称为,Goldberg-Hognessbox,，是,RNA,聚合酶,的结合部位。,五、转录与复制的异同,相同：,模板：,DNA,原料：三磷酸核苷酸,遵守碱基配对规律,模板阅读,方向：,3,5,；,新链合成方向：,5,3,酶：依赖,DNA,的聚合酶,产物：多核苷酸链,不同,：,复制,转录,模板,DNA,双链,DNA,模板链,原料,dNTP NTP,配对,A,T,，,G,C A,U,，,T,A,，,G,C,酶,DDDP DDRP,产物 子代,DNA,（半保留）,RNA,（,mRNA tRNA,、,rRNA,等）,引物 小段,RNA,不需要引物,可分为,起始,、,延长,、,终止,三个阶段,1,、转录过程以,DDRP,全酶辩认并结合,DNA,模板而开始。,2,、随着酶的向前移动（,5,），转录产物,RNA,不断延长。,3,、当转录酶到达终止信号处，酶与,DNA,模板分离、,产物,RNA,脱落、转录即告结束。,4,、真核生物的转录产物还需有,“,转录后加工,”,的过程。,三、,RNA,的转录过程,1,、,RNA,聚合酶全酶辨认、结合到模板的启,动区在真核细胞还有一些特异调控,DNA,称顺式,调控元件，还有一些辩认,DNA,的蛋白质称反式,调控因子共同参与转录起始过程。,（一）转录的起始,2,、解开,DNA,双链，形成“转录空泡”。,1,）较早认为,RNA,聚合酶与,DNA,结合后，“挤,入”双螺旋结构之内，使,DNA,解链，不需,其他辅助因子。,目前认为拓扑酶,II,也参与作用，形成负超螺,旋，有利于转录。,2,）解链的范围不大（,1020bp,）,形成转,录空泡。,3,、起动复合物形成，转录开始：,不需引物，,RNA,聚合酶在起始部位催化两,个核苷酸形成磷酸二酯键。第一个核苷酸,常为,GTP,，,GTP,与随后的,NTP,生成,PPPGPN,-,OH,，仍保留三磷酸鸟苷状态。,因此常把,RNA,聚合酶全酶,-DNA-PPPGPN,-,OH,称为转录的起始复合物。,4,、,因子从全酶脱落，可重复利用。,1,、核心酶沿着模板滑动，催化四种,NTP,按碱基配对原则生成长的核苷酸链，方向,5,3,。核心酶经过后，,DNA,双链复合为双螺旋，,RNA,链与模板分离。,2,、因同一,DNA,上可多位点同时转录；又因,DNA DNA,较,DNARNA,结构稳定，故,RNA,易被排斥分离，在电镜下，同一,DNA,模板上，长短不一的,RNA,链散开成羽毛状图形。,3,、同时将转录过程形成的“酶,-DNA-RNA”,复合物称为转录复合物。,4,、对于较长的,mRNA,，可一边转录、一 边与核糖体结合而开始“翻译”过程。,（二）转录的延长,DDRP,（核心酶）在模板的“转录终止点”停顿，酶,模板分离，,RNA,脱落。,1,、依赖,因子帮助：,因子帮助,RNA,聚合酶辩认终点并停止转录。,因子与,RNA,结合（主要与,PolyC,亲和力最大）,RNA-DNA,杂化双链的短链变性,利于转录产物从转录复合物中释放。,因子有,ATP,酶与解链酶活性。,2,、不依赖,因子,RNA,产物形成特殊结构来终止转录。在近转录终止区，转录产物常出现多个“,UUUU.”,结 构，在此结构之前，转录产物形成“发夹样”或“柄鼓泡”样结构，这种二级结构是阻止转录继续向下游推进的关键。,（三）转录终止,四、转录过程的抑制剂,无论原核或真核生物，初级转录产物都经过一定程度的修饰和加工才表现功能。真核生物转录后加工修饰更复杂，故主要介绍真核生物。,（一）,mRNA,的转录后加工,1,、首尾修饰,（,1,）,5,端带帽：即,GPPP,m,G,。其功能：一 种翻译起始因子可和帽子结构结合，故与翻译过程有关。,（,2,）,3,端接尾；即,PolyA,，一般,100200bp,。,其功能：维持,mRNA,作为翻译模板活性，增加,mRNA,稳定性。,五、转录后的加工,2,、内部剪接,（,1,）断裂基因（,Split gene,）、外显子（,exon,）和内含子（,intron,）,a,断裂基因,真核生物的结构基因常由若干,个编码区及非编码区间隔连续镶嵌而成，称之,b,外显子,基因中（包括,hnRNA,）能编码,AA,的片段。,c,内含子,基因中（包括,hnRNA,）非编码,AA,的片段。,原核生物结构基因是连续的编码序列，无断裂 基因。,（,2,）,mRNA,的剪接：即剪去内含子，拼接外显子断裂基因经转录形成,hnRNA,，,hnRNA,剪去内含子，拼接外显子，成为成熟的,mRNA,（二）,tRNA,的转录后加工,tRNA,为,DDRPIII,的转录产物,1,、剪接：去除插入的碱基。,2,、生成各种稀有碱基：即除,A,、,C,、,G,、,U,以外的,碱基，如,DHU,、,、,I,等。,1,甲基化：,A,A,m,G,G,m,2,还原反应：,U,DHU,3,核苷内转位反应：尿嘧啶核苷,假尿苷,（,C5,C1,）,4,脱,NH3,：,A,I,3,、,3,端加入,CCA-OH,未端，完成氨基酸臂的,（三）,rRNA,的转录后加工,rRNA,的基因（,rDNA,）属丰富基因族的,DNA,序列，有高度重复序列，这些序列可被不能转录为,mRNA,的间隔区分隔组成。,一,rRNA,的加工：,rRNA,在胞核内经转录形成,45S-rRNA,，后者经加工剪接形成,18S-rRNA,和经拼接形成,5.8s,及,28s-rRNA,。三种,rRNA,一起和核糖体蛋白构成核糖体，进入胞质。,二,rRNA,的自我剪接与,ribozyme(,核酶,),研究发现一些低等真核生物细胞核的,rRNA,，其剪接不需任何蛋白质参与，故认为,RNA,分子具有酶的活性，从而提出核酶的概念。,1,、核酶（,ribozyme,）：具有催化作用的,RNA,。主要参与,RNA,的自我剪接过程,2,、核酶二级结构,槌头状结构，包括有底物部位（含,G,、,U,序列）和催化部位（有三个茎及,1,或,2,个环）。,一、概念：,基因工程是在体外将分离纯化或人工合成的,DNA,与载体,DNA,结合，成为重组,DNA,，用以转化宿主（细菌或其他细胞），然后筛选出能表达重组,DNA,的活细胞，加以纯化、传代、扩增，成为克隆的技术。因此基因工程也称为基因克隆或重组,DNA,技术。,克隆,(,Clone,),亲代细胞通过无性繁殖而产生一组单一细胞的过程称之。,克隆也表示从单一亲代细胞通过无性繁殖而产生的一组单一的细胞。,第二节 基因工程操作技术,已用限制性内切酶切开的质粒,DNA,给体,DNA,片段,给体,DNA,重组质粒,染色体,DNA,细菌,细菌的转化与含重组质粒的细菌的筛出,已转化的细菌,细菌繁殖,含该重组质粒的细菌克隆株,基因工程技术示意图,一,分,载体和目的基因的分离,1,、常用载体：质粒、,噬菌体、,M13,噬菌体等。,此外还有逆转录病毒,DNA,、昆虫病毒,DNA,。,对载体的要求：,1,能独立复制，但需宿主的酶体系进行基因表达。,2,有筛选标记：如抗药性基因。,3,分子量不大，尽可能有多种内切酶的单一位点。,4,可通过破碎细菌，用密度梯度离心法分离。,（,5,）容易进入受体细胞,二、基因工程的五大步骤,（分、切、接、转、筛）,EcoRI,0,HindIII,29,BamHI,375,SalI,650,AvaI,1425,PvuII,2066,PstI,3609,耐氨苄青霉素基因,耐四环素基因,2,、目的基因的来源：,1,直接从染色体,DNA,分离，多用于原核生物。,2,人工合成。,3,从,mRNA,合成,cDNA,，需反转录酶。,4,基因文库：是含有某种生物体全部基因的,随机片段的重组,DNA,克隆群体。包括,G,文库（总,DNA,文库）、,C,文库（,cDNA,文库）。,基因文库制备过程：全部,DNA,分离提纯，经过,酶切形成,DNA,片段，重组入同一个载体，成为重,组体，再转化到细菌保存起来。,基因文库包括：,（,1,）,G,文库,用基因组的总,DNA,来制备的,称之。,（,2,）,C,文库,用细胞全部,mRNA,经反转录,生成,cDNA,，以之来建库。,应用“探针”可把目的基因钓出。,二,切,限制性内切酶的应用,1,、作用,识别核酸分子某些碱基序列并,加以切开。不同的限制酶其酶切点不同。,酶辩认的碱基序列一般为,46,个，而且这,些碱基序列大多有回文结构。,2,、回文结构,即碱基排列顺序在顺读和反,读都是一样的。,3,、酶作用的切口,（,1,）平端切口,同一水平上切断,DNA,两股链。,（,2,）粘端切口,两链切口错开,24,个核苷酸,如为四核苷酸切口，切口机率,=,（,1/4,）,4,=1/256,如为六核苷酸切口，切口机率,=,（,1/4,）,6,=1/4096,4,、目的基因尽可能完整的切出。将载体切开、,以接纳目的基因。,常用的限制性内切酶,三,接,载体和目的基因连接成重组体,用同一酶切割载体和目的基因，两者切口,端往往互补，可用连接酶连接成为重组体。,连接方式有：,1,、粘端连接方式：,在载体和目的基因上有共同酶切位点。,2,、人工连接器：在载体和目的基因上连上人工,合成的一段寡核苷酸，其碱基上含内切酶酶,切位点，可达到连接目的。,3,、尾接法：在载体和目的基因上无共同,的酶切位点。,四,转,重组体的转化,即将重组体转入细菌体或细胞，重组体引,起宿主转化。,常用,CaCl,2,处理细菌或细胞，使之膜通透性,增加，再将重组体直接引入细胞。,五,筛,DNA,重组体筛选与鉴定,先扩增,筛选出含目的基因的菌株,反,复筛选后克隆化,再扩增,1,、表型筛选：,1,利用载体质粒对抗生素的耐药性进行筛选。,如质粒,PBR322,，对四环素及氨苄青霉素均耐药，如该质粒重组体导入无耐药的宿主菌后，此细菌变成有耐药性，可在含四环素及氨苄青霉素的培养基中生长。反之，无质粒重组体转化的宿主菌在该培养基中被杀死。,See Fig,2,、电泳法（,DNA,限制酶切图谱分析）：,将重组体、原载体经限制性内切酶切割后，,进行电泳，据,DNA,片段大小与有无来区分载体,是否重组。,3,、核酸杂交：,将“目的基因”标记作为探针，与吸附有菌,落,DNA,的滤膜一起温育，若菌落含有目的基,因，可与探针结合，经放射自显影可显示出来。,一、聚合酶链反应（,PCR,）的概念,：,PCR,即是一种体外快速扩增特异,DNA,片段,的技术。它是在模板,DNA,、引物、,4,种,dNTP,和缓冲液存在的条件下依赖耐热,DNA,聚合酶,的酶促循环合成反应。,循环反应分三步：,（,1,）变性，,（,2,）退火，,（,3,）延伸。一般进行,2530,次循环。在约二小,时内可扩增,10,6,10,9,倍,三、聚合酶链反应,二、反应系统,；模板、引物（上、下游引物）、,dNTP,、耐热,DNA,聚合酶（,Taq,酶）、绶冲,液等。,三、基本步骤,：,一,变性：约,96,，,15,S,，模板解链。,二,退火：约,55,，,30,S,，引物与模板粘合。,三,延伸：约,72,，,1.5,min,，酶沿引物方向,催化新链合成。,最后一次循环的“延伸”时间为,5min,。,四,电泳分离产物。,四、基因工程产品的开发与应用,一,基因工程疫苗：生产乙型肝炎、甲型肝,炎疫苗等。,二,生产激素类：胰岛素、生长素等,三,细胞因子：由免疫细胞和基质细胞产生,的高活性、特异性强的调节蛋白。,如多种生长因子（,GF,）、肿瘤坏死因子,（,TNF,）、多种造血因子、干扰素等。,