甘肃蚤缀乙酸乙酯部位对肺纤维化小鼠肺组织的保护作用.pdf

，（）：，（），（）：，：，（）：赵长青，徐列明 扶正化瘀制剂抗肝纤维化和治疗慢性肝病的临床疗效 上海医药，（）：；刘平，吴定中，刘成海，等 扶正化瘀中药复方促进大鼠肝纤维化逆转的配伍机理研究 上海中医药大学学报，（）：甘肃蚤缀乙酸乙酯部位对肺纤维化小鼠肺组织的保护作用朱梦莹，沈 娜，辛化伟，郝春香，刘艳霞，崔玉磊（临沂大学医学院，山东 临沂）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）；中国博士后基金项目（）；山东省博士后创新人才支持计划项目（）；大学生创新创业项目（）作者简介：朱梦莹（），女，研究方向为天然药物化学。：，：通信作者：崔玉磊（），男，博士，讲师，从事天然药物化学研究。：，：摘要：目的 探究藏药甘肃蚤缀乙酸乙酯部位对肺纤维化小鼠肺组织的保护作用。方法将 只小鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组（比菲尼酮）和乙酸乙酯部位低、中、高剂量组（、），每组 只（雌雄各半）。假手术组小鼠气管内缓慢滴入生理盐水溶液（约 ），其余各组小鼠气管内缓慢滴入等体积博来霉素（），建立肺纤维化动物模型。连续给药 后，观察小鼠肺组织病理变化，检测肺系数、羟脯氨酸水平，采用 法检测小鼠血清、水平和 活性，免疫荧光法检测肺组织 蛋白表达，法检测肺组织、蛋白表达。结果 假手术组小鼠肺泡壁纤细，间质无炎性细胞浸润和胶原沉积。与假手术组比较，模型组小鼠肺组织间质有明显炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，肺泡腔塌陷，胶原沉积明显，肺系数、肺泡炎症、肺纤维化评分升高（）；肺组织羟脯氨酸、水平升高（），活性降低（）；肺组织、蛋白表达升高（），蛋白表达降低（）。与模型组比较，乙酸乙酯部位组小鼠肺组织炎性细胞浸润逐渐减轻，纤维化逐渐改善，胶原沉积减少，肺系数、肺泡炎症、肺纤维化评分降低（）；肺组织羟脯氨酸、水平降低（），活性升高（）；肺组织、蛋白表达降低（），蛋白表达升高（），且呈剂量依赖性。结论 甘肃蚤缀乙酸乙酯部位具有抗肺纤维化作用，并呈剂量依赖性，其作用机制可能与其抑制 和 信号通路以及激活 信号通路有关。关键词：甘肃蚤缀；乙酸乙酯部位；肺纤维化；炎症；氧化应激；中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：特发性肺纤维化（，）是以肌成纤维细胞异常活化、细胞外基质（，）过度沉积、肺瘢痕形成为特征的一种特殊弥漫性间质性肺病，预后差，患病率和死亡率逐年上升。据报道，诊断后的中位生存期仅 年，且 危重患者也伴随严重肺纤维化。目前，尚无疗效好且毒副作用小的药物或治疗手段。肺纤维化的发病机制虽未阐明，但研究表明氧化应激、炎症和纤维化是引发肺纤维化的关键途径，其中主要涉及、和 等信号通路。研究发现，是调控氧化应激的关键核转录因子，可入核并启动多种抗氧化基因转录翻译相关抗氧化蛋白，减轻机体损伤。信号通路对肌成纤维细胞的形成、细胞外基质的沉积均有重要影响。因此，开发可同时作用于以上多途径的新型抗肺纤维化药物有重要意义。藏药甘肃蚤缀 为石竹科蚤缀属多年生的垫状草本植物，在藏族地区已广泛用于治疗间质性肺病。现代药理学研究表明，甘肃蚤缀具有良好的抗 年 月第 卷 第 期中 成 药 炎、抗氧化和免疫调节等作用。课题组前期实验证明甘肃蚤缀总提取物具有抗肺纤维化生物活性，为了进一步探寻其活性部位及分子作用机制，本实验对甘肃蚤缀乙酸乙酯部位的抗肺纤维化作用进行评价，并对其机制进行探究，以期为其进一步开发利用提供理论依据。材料 药物 甘肃蚤缀采自青海省西宁市达坂山，由中国科学院西北高原生物研究所梅丽娟研究员鉴定为石竹科蚤缀属甘肃蚤缀 ，药材标本（编号）存放于中科院西北高原生物研究所青藏高原博物馆内。新鲜甘肃蚤缀样品在室温下阴干，粉碎成细粉并过筛，得到粉末。将干燥粉末（）在 下用 倍量 乙醇提取 次，每次 ，萃取物经过减压浓缩至 ，然后分别用石油醚和乙酸乙酯等体积萃取 次，合并乙酸乙酯萃取液，减压浓缩成浸膏，冻干得乙酸乙酯部位，相当于生药的得率为 ，用 溶液配制成质量浓度为 的混悬液，备用。试剂，抗体（货号、，英国 公司）；标记和辣根标记的二抗抗体（货号、，北京百普赛斯生物科技 股 份 有 限 公 司）；注 射 用 盐 酸 博 来 霉 素（货 号，海正辉瑞制药有限公司）；阳性药比菲尼酮（货号，北京谨明生物科技有限公司）；氯化钠注射液（规格 瓶，批号，山东齐都药业有限公司）；、试剂盒（货号、，北京索莱宝科技有限公司）；羟脯氨酸、和 试剂盒（货号、，上海酶联生物科技有限公司）；和 染色试剂盒（货号、，北京索莱宝科技有限公司）。动物 只清洁级健康 小鼠，购于甘肃中医药大学 实验动物生产许可证号 （甘），雌雄各半，周龄，体质量 。饲养环境适宜，通风良好，昼夜节律，温度（），相对湿度 ，雌雄分养，每隔 更换 次垫料，颗粒饲料喂养，自由饮食、饮水，实验动物使用许可证号（甘）。实验动物适应 周后按照体质量随机分组进行实验。所有小鼠在实验前饥饿处理 ，实验操作均在上午 到下午 之间进行。在整个实验过程中所涉及的动物实验均得到了动物保护和使用机构的批准，并严格按照规定进行实验。方法 造模 采用气管滴入博来霉素溶液的方法建立小鼠肺纤维化模型。小鼠用 水合氯醛麻醉固定后，沿颈正中切开 ，钝性分离至气管，用注射器经气管软骨环间隙向气管内缓慢注入博来霉素（，约 ）；假手术组则向气管内缓慢注入等体积生理盐水溶液，缝合切口并将每只小鼠直立进行左右缓慢晃动数秒，确保小鼠左右肺内药液均匀分布。手术后缝合皮肤，待动物自然清醒后将其置笼内常规饲养，并每日进行常规室内清洁消毒。分组及给药造模 周后，随机选取 只小鼠（雌雄各半），麻醉后脱颈处死，摘取肺组织，制作切片并观察病理情况来确定模型是否成功。将造模成功的小鼠分为模型组、阳性对照组（比菲尼酮）和乙酸乙酯部位低、中、高剂量组（、），每组 只（雌雄各半），分组完成后当天开始给药，假手术组和模型组灌胃等量 水溶液，连续 。小鼠肺系数检测给药 后，将小鼠用 水合氯醛麻醉，称重取血后，平放于鼠板之上，用 酒精轻轻擦拭胸部和腹部的皮肤，用剪刀依次将剪开腹部和颈部，完整分离出双肺，用 将肺组织表面血迹洗净，吸干肺脏表面水分，立即称重，称取肺湿量，计算肺系数。和 染色观察肺组织病理学将右肺置于 多聚甲醛中固定约 ，经梯度乙醇脱水后，浸入 中于 冰箱中预冻 ，然后放入冷冻切片机冻台上冷冻（），制备切片（），按照试剂盒操作说明书分别进行 和 染色。镜下观察过程采用从低倍镜到高倍镜，从整体到局部，从宏观到微观的方法，并参照 分级标准判定肺泡炎和纤维化的程度，见表。表 肺泡炎症和肺纤维化分级及评分标准（法）评分 分肺泡炎症肺纤维化无无轻度炎症，单核细胞浸润，肺泡间隔增宽，限于局部和近胸膜部位，面积小于全肺 ，肺泡结构正常轻度纤维化，胸膜近处有间质纤维化，面积小于全肺 ，整体肺泡结构开始紊乱。中度肺泡炎症，面积占全 ，近胸膜处较严重中度纤维化，局部纤维化，病变区域从胸膜延伸，面积占全肺 。肺泡炎大于 ，偶见肺泡内有单核细胞及出血造成的实变重度纤维化，出现大小不等的囊气腔，病变大于 。免疫荧光染色检测 蛋白表达肺组织切片浸于枸橼酸盐缓冲液（），加热到，持续 进行抗原修复，冷却至室温后，冲洗 次，加入 过氧化氢室温下静置 ，以阻断内源性的过氧化物酶，冲洗 次，滴加 室温封闭 ，弃封闭液，分别加入一抗（）孵育过夜，冲洗 次，室温孵育 标记的二抗（），染色 ，冲洗 次，然后经过梯度乙醇脱水后，二甲苯透化，封片后镜检。荧光显微镜拍摄时均采用统一曝光时间，蛋白相对表达量采用 软件进行定量分析。肺组织中羟脯氨酸水平检测 称取 小鼠左肺组织，加入 倍量预冷的生理盐水，冰浴匀浆，转移至离心 年 月第 卷 第 期中 成 药 管中备用。取 待测样本，加入 消化液，混匀后置于 水浴锅中孵育 ，过滤，滤液使用羟脯氨酸试剂盒定量检测羟脯氨酸的水平，用羟脯氨酸水平间接代表肺组织中胶原沉积水平。法检测小鼠血清炎症和氧化应激相关因子水平 小鼠摘眼球取血，室温放置 ，、离心 ，取上层血清，按照试剂盒说明书采用 法检测炎症细胞因子（和）和氧化应激相关因子（和）水平。法检测肺组织、和 蛋白表达 取于 保存的右肺组织，加液氮研磨，使用 裂解液裂解提取蛋白，、离心，取上清液即得总蛋白，试剂盒检测总蛋白浓度，加上样缓冲液于金属浴 变性 ，即得蛋白样本。蛋白上样，凝胶电泳后转移至膜，经封闭、孵一抗、二抗及显影，检测相关蛋白表达。统计学分析通过 软件进行处理，数据以（）表示，组间比较采用单因素方差分析和 检验。为差异具有统计学意义。结果 甘肃蚤缀乙酸乙酯部位对肺纤维化小鼠肺组织病理变化的影响 如图 所示，染色结果表明，假手术组小鼠肺组织结构正常，肺泡间隔纤细，肺泡、气管形态正常，排列规律，未见炎性细胞；模型组小鼠肺组织炎性细胞浸润，肺泡间隔增宽并增厚，肺泡腔明显坍塌，肺纤维化明显；随着乙酸乙酯部位给药剂量的增加，小鼠肺组织纤维化逐渐改善，炎性细胞浸润程度逐渐减轻。结果表明，假手术组小鼠肺组织形态正常，未见明显蓝色胶原纤维沉积；模型组小鼠肺泡结构模糊，大量亮蓝色胶原纤维呈弥漫性沉积在肺组织中，呈现出典型的肺纤维化状态；随着乙酸乙酯部位给药剂量的增加，小鼠肺结构逐渐清晰，肺间质中大面积亮蓝色胶原纤维逐渐减少，肺泡间间质增生减少，少有蓝色区域。肺组织病理评分如表 所示，乙酸乙酯部位可改善小鼠的肺纤维化（，）。图 各组小鼠肺组织病理形态（）表 各组小鼠肺泡炎症和肺纤维化分级评分比较（分，）组别肺泡炎症肺纤维化假手术组模型组 乙酸乙酯部位低剂量组 乙酸乙酯部位中剂量组 乙酸乙酯部位高剂量组 阳性对照组 注：与假手术组比较，；与模型组比较，。甘肃蚤缀乙酸乙酯部位对肺纤维化小鼠肺系数及羟脯氨酸水平的影响如图 所示，与假手术组比较，模型组小鼠肺系数和羟脯氨酸水平均升高（），表明博来霉素可引起小鼠肺组织水肿和增加肺组织胶原蛋白沉积；与模型组比较，阳性对照组和乙酸乙酯部位中、高剂量组小鼠肺系数和羟脯氨酸水平均降低（，），而低剂量组各指标均无明显变化（）。甘肃蚤缀乙酸乙酯部位对肺纤维化小鼠肺组织纤维化标志蛋白表达的影响 图 显示，与假手术组比较，模型注：与假手术组比较，；与模型组比较，。图 各组小鼠肺系数和羟脯氨酸水平（，）组小鼠肺组织 蛋白表达升高（）；与模型组比较，阳性对照组和乙酸乙酯部位中、高剂量组小鼠肺组织 蛋白表达降低（，），而低剂量组无明显变化（）。图 显示，与假手术组比较，模型组小鼠血清 水平升高（）；与模型组比较，阳性对照组和乙酸乙酯部位高剂量组小鼠血清 水平降低（），而低、中剂量组无明显变化（）。年 月第 卷 第 期中 成 药 注：与假手术组比较，；与模型组比较，。图 各组小鼠肺组织 和 表达（，）甘肃蚤缀乙酸乙酯部位对肺纤维化小鼠血清炎症和氧化应激水平的影响 如图 所示，假手术组小鼠血清、水平升高（），活性降低（）；与模型组比较，阳性对照组和乙酸乙酯部位中、高剂量组小鼠血清、水平降低（，），活性升高（，），而低剂量组无明显变化（）。注：与假手术组比较，；与模型组比较，。图 各组小鼠血清、水平和 活性（，）甘肃蚤缀乙酸乙酯部位对肺纤维化小鼠肺组织、和 蛋白表达的影响图 显示，与假手术组比较，模型组小鼠肺组织、蛋白表达升高（），蛋白表达降低（）；与模型组比较，阳性对照组和乙酸乙酯部位中、高剂量组小鼠肺组织、蛋白表达降低（），蛋白表达升高（），而低剂量组无明显变化（）。讨论肺系数是评价肺损伤的重要指标，肺组织受到损伤，肺系数明显增大。甘肃蚤缀乙酸乙酯部位可明显降低肺系数，缓解肺组织损伤程度。肺组织病理实验结果表明，随着乙酸乙酯部位给药剂量的增加，小鼠肺组织结构损伤程度得到明显改善，肺组织间炎性细胞减少。肺组织 的累积是肺纤维化的主要病理特点，通常将胶原蛋白水平作为 累积多少的参考标准，同时胶原蛋白可作为判定肺间质纤维化早期或活动期的理想评价指标。羟脯氨酸是机体胶原蛋白水平最高的氨基酸，可作为胶原蛋白组织代谢的重要指标。本研究通过组织 染色发现乙酸乙酯部位可明显降低肺组织内胶原蛋白沉积，且进一步通过羟脯氨酸定量分析明确了乙酸乙酯部位抑制肺组织胶原蛋白沉积效果。以上结果表明，乙酸乙酯部位能改善肺纤维化的程度。肌成纤维细胞是产生胶原蛋白的主要效应细胞，慢性损伤过程引发的持续性氧化应激和炎症导致肌成纤维细胞异常转化，使其无法逆转为正常细胞，并具有高表达 和难于凋亡的特点，还可以产生组织金属蛋白酶抑制剂抑制 的溶解和消除，导致组织修复异常，局部形成高度交联的坚硬疤痕，引发肺纤维化。是肌成纤维细胞的标志蛋白，也是肺组织产生纤维化的标志蛋白。是引发机体纤维化的关键驱动因子，可促进肺泡上皮细胞增殖分化为肌成纤维细胞，促使大量 和胶原蛋白等基质蛋白聚积在细胞外基质中，导致肺纤维化的产生。本研究结果显示，乙酸乙酯部位可明显抑制 的表达，降低 水平，表明乙酸乙酯部位可通过抑制肌成纤维细胞异常转化从而抑制肺纤维化。是体内清除氧自由基的重要酶，可以清除氧自由基，并且可以间接反应机体清除氧自由基的能力。是体内重要的脂质过氧化物，可以间接反应机体受氧自由基损伤的程度。年 月第 卷 第 期中 成 药 注：与假手术组比较，；与模型组比较，。图 各组小鼠肺组织、和 蛋白表达（，）博来霉素可降低小鼠 活性，增加 以及炎症因子 水平，促进肌成纤维细胞的转化，加速肺纤维化的形成。本研究发现乙酸乙酯部位组小鼠血清炎症因子 和氧化应激因子 水平均降低，活性增加，表明乙酸乙酯部位具有抑制肺纤维化小鼠炎症和氧化应激损伤作用。大量研究表明，氧化应激、炎症和纤维化是导致肺纤维化发病的关键途径，信号通路是调控肌成纤维细胞异常转化进而引发肺纤维化的关键信号通路，是激活该信号通路的关键细胞因子，本实验结果表明乙酸乙酯部位可明显抑制 的表达，且进一步验证发现 的表达同样受到抑制，说明乙酸乙酯部位具有抑制 信号通路的作用。此外，乙酸乙酯部位还可以抑制 的表达，说明乙酸乙酯部位对 信号通路也具有调控作用。研究表明，细胞因子的产生主要受 的调控，信号通路激活后，一方面通过产生各种细胞因子加速肺纤维化的形成，另外一方面 还可直接调控 信号通路引发肺纤维化。信号通路的激活会引发机体产生大量，引发机体产生氧化应激损伤，作为清除体内 的重要核因子 在肺纤维化病理状态下表达明显降低。高表达可抑制 信号通路，且能降低肺纤维化严重程度。本研究结果表明乙酸乙酯部位具有促进 表达，降低氧化应激的作用。综上所述，甘肃蚤缀乙酸乙酯部位具有抗肺纤维化作用，并呈剂量依赖性，其作用机制可能与其抑制 和 信号通路以及激活 信号通路有关。参考文献：李 想，常 虹，石松利，等 肺纤维化的中医病机及中医药治疗研究进展 中药药理与临床，（）：蔡 松，蒋锋利，黄茂，等 大黄蛰虫丸对博来霉素致肺纤维化大鼠 信号通路的影响 环球中医药，（）：张浩洋，吕晓东，庞立健，等 中药注射液治疗特发性肺纤维化有效性及安全性系统评价 辽宁中医药大学学报，（）：赵亚萍，马 辉，曹洁 新型冠状病毒肺炎潜在的发病机制及间充质干细胞治疗作用的研究进展 天津医药，（）：付际游，马子风，鹿振辉，等 中药治疗特发性肺纤维化相关机制的研究进展 中医药导报，（）：邓晓玲，许 飞 特发性肺纤维化发病机制研究进展实用临床医学，（）：李少峰，魏兴洪，高洁，等 温肺化纤汤干预肺纤维化大鼠肺组织中 含量研究 亚太传统医药，（）：，年 月第 卷 第 期中 成 药 ，（）：杨俊侠，曹述任，顾文超 穿山龙总皂苷经 通路减轻博莱霉素所致大鼠肺纤维化的实验研究中国药师，（）：林咏梅，肖勇洪 中医药治疗特发性肺纤维化研究进展 世界中医药，（）：许本善，雷 宁，吕亚丽，等 雪灵芝醇提物不同极性萃取部分的体外抗氧化活性 中国实验方剂学杂志，（）：崔玉磊 藏药甘肃蚤缀化学成分及抗肺纤维化生物活性研究 北京：中国科学院大学，（）：张成华，朱庆均，田景振 博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型评价及应用研究进展 中南药学，（）：，：，（）：，：，：，：，：王 琼 通过 激活 诱导特发性肺纤维化发病机制的研究 南京：南京医科大学，（）（），：野生与栽培甘草对马钱子致肝毒性的解毒作用马 骏，曼 琼，闫 潇，邓 毅，杨志军，杨秀娟（甘肃中医药大学，甘肃 兰州；甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃 兰州）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）；甘肃省自然科学基金项目（；）作者简介：马 骏（），男，硕士生，从事中药及复方临床应用研究。：，：通信作者：邓 毅（），男，教授，从事中药及复方应用基础研究。：，：摘要：目的 比较野生甘草与栽培甘草对马钱子致肝毒性的解毒作用。方法 大鼠随机分为正常组、模型组、野生甘草组和栽培甘草组，每组 只，模型组大鼠灌胃给予马钱子提取物，野生甘草组和栽培甘草组大鼠在给予马钱子提取物 后灌胃给予各甘草提取物，连续 。给药结束后检测各组大鼠血清谷草转氨酶（）和谷丙转氨酶（）活性，苏木素伊红（）染色观察肝组织病理变化，酶联免疫吸附法（）检测肝组织 活性和、水平，法检测肝组织、和 蛋白表达。结果 野生甘草与栽培甘草均能降低大鼠血清、和肝组织 水平（，），修复受损肝脏细胞，提高 水平和 活性（，），抑制、和 蛋白表达（）。结论 野生与栽培甘草均可缓解马钱子所致的肝毒性，其作用机制可能与调节炎症、细胞凋亡、氧化应激、药物代谢酶因子相关，栽培甘草对氧化应激、药物代谢相关因子的调控效果优于野生甘草。关键词：甘草；野生；栽培；马钱子；肝毒性；解毒中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：马钱子为马钱科植物马钱 的干燥成熟种子，味苦，性温，有大毒，归肝、脾经，具有通络止痛、消肿散结的功效，用于跌打损伤、骨折肿痛、风湿顽痹等。马钱子的主要成分为马钱子碱和士的宁，其既是有效成分也是毒性成分，马钱子碱在肝脏具有较高浓度的特性，易导致肝脏毒性损伤。现代研究表明，甘草具有抗肿瘤、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、护肝和免疫调节等作用。甘草提取物能够有效减少马钱子碱和士的宁的吸收速度，且能缓解马钱子的肾毒性。甘草对马钱子肝毒性的解毒作用尚未见报道，本实验通过观察野生 年 月第 卷 第 期中 成 药