生物化学实验课.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生物化学实验,用离心、电泳、层析、分光光度等技术对生物分子尤其是生物大分子进行分离、提取、纯化和鉴定。,考核办法：,平时考查：20%,实验报告：20%,笔试成绩：60%,实验内容：,实验37 醋酸纤维薄膜电泳分离蛋白质,实验3 唾液淀粉酶活性观,实验20 血浆IgG的分离制备,实验32 IgG的凝胶层析脱盐,实验38 聚丙烯酰胺电泳分离蛋白质,实验43 乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离,实验50 质粒DNA提取与鉴定,实验48 酶联免疫吸附测定,实验一 醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白质,教学目的：,了解电泳的一般原理、掌握醋酸纤维薄膜电泳操作技术,实验原理、点样、电泳槽组装、,结果观察、透明各环节的把握,重点难点：,一,、,原理:,以醋酸纤维薄膜为电泳支持物，分离各种血清蛋白。,血清中的各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、等电点、分子量及形状不同，在电场中迁移速度不同。,我国正常人血清蛋白质组成,+,_,pH8.6,原理,2.制作电桥。（2层滤纸或4层纱布）,操作,3.点样：,薄膜非光泽面朝上平放在滤纸条上,用玻片取样垂直的印在薄膜边缘1.5cm处形成一,定宽度、粗细均匀的直线,操作,样,品,带,窄,而,均,匀,4.电泳：,薄膜点样面朝下，样品端朝负极平贴在电泳槽支架上，盖盖使膜平衡10 min。,操作,4.电泳：,起始电流0.6mA/片，电泳1015min后调至1mA/片，电泳50 min。电流回0，关机。,5.染色2 min，漂洗液脱去背景颜色。,染色液重复使用,操作,置甲液2min，乙液1min，,贴于载玻片上，2min膜完全透明。,6.透明：,7.观察分析结果,电泳图谱显示的内容：,正负极,条带数目,条带宽窄,条带颜色深浅,条带形状,条带间距,操作,四、实验报告的格式及要求：,原理、操作（简明）。,铅笔绘电泳结果图谱，图谱要求显示以下内容：,正负极、条带数、条带间距、带型和各蛋白,质条带的名称。,3.要求字迹整洁。,五、思考题,电泳的一般原理；,醋酸纤维薄膜电泳的特点；,根据人血清中血清蛋白各组分等电点，如何估计,它们在pH8.0的巴比妥-巴比妥钠电极缓冲液中,移动的相对位置。,实验二 唾液淀粉酶活性的观察,教学目的,掌握酶的化学本质；,酶催化作用的特点；,了解酶活性观察实验的设计特点。,实验原理；,实验现象的观察；,实验条件的把握。,重点难点,一、原理,酶活力 酶催化化学反应的能力,加碘液跟踪水解过程：,淀粉,淀粉酶,淀粉酶,糊精,麦芽糖,+,葡萄糖（少量）,蓝色,紫色,红色,黄色或无色,蓝色,无色,时间短，酶活性高即酶的,最适条件,酶活力受环境因素的影响。本实验通过观察温度、pH、激活剂、抑制剂等对酶活性的影响，掌握酶作为,生物催化剂的作用特点。,二、操作 （表3-1不做）,小组1位同学先用蒸馏水漱口三次，然后口含20ml蒸馏水2min，吐入塑料水杯，即得酶液。,1、唾液淀粉酶的制备,2、温度对酶活性的影响,操作,淀粉+pH6.8缓冲液+酶液,冰浴,沸水浴,37,淀粉+pH6.8缓冲液+酶液,冰浴,沸水浴,37,碘液检查,37,管呈无色,时同时向各管加碘液,2、温度对酶活性的影响,颜色,说明：,先冷却后加碘液,3、pH对酶活性的影响,淀粉 +,pH,5.0,6.8,8.0,+酶液,37,碘液检查,pH6.8,管呈红色时同时向各管加碘液,颜色,说明：,4、酶作用的专一性,淀粉,蔗糖,+酶液,37,10min,斑氏试剂,2-5min,沸水,现象,说明：,5、激活剂、抑制剂对酶活性的影响,淀粉+缓冲液+,1%NaCl,1%CuSO4,蒸馏水,碘液检查,1%NaCl,管呈红色时同时向各管加碘液,+酶液,颜色,37,说明：,淀粉酶活性观察的原理,操作（用表格表示）,结果（结果可附在操作表格中）,结果说明（紧随各实验操作之后）,三、实验报告要求：,了解酶作用特点后，应用酶时应该注意些什么？,2.酶性质鉴定实验的设计有什么特点？,四、思考题,刻度吸管与试剂严格对应；,反应液必须充分混匀；,试剂、仪器及时回位；,实验结束各自清洁台面,及所用仪器；,5.刻度吸管按图示清洁；,注意事项：,注意事项：,6,、按图示整理好桌面即可离开实验室；,7、值日生负责整个实验室清洁，水、电、门窗安全。,