细胞生物学技术细胞转染与传代.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞转染和传代,实验目的：,理解细胞转染的原理,掌握细胞转染的操作步骤。,学习操净台内操作及注意事项,掌握贴壁细胞传代方法和细胞计数板的使用,学习荧光显微镜的结构、操作及注意事项。,关于转染（,transfection,）,细胞转染是指将外源的,DNA,，,RNA,等导入真核细胞,的技术，是实验室工作中经常涉及的基本方法。,外源核酸在细胞中的定位,物理介导：电穿孔法、显微注射,化学介导：磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法,生物介导：病毒介导法,常用的转染方法,细胞转染的类型,瞬时转染：外源,DNA/RNA,不整合到细胞的染色体中，因此一个细胞中可存在多个拷贝数，产生高水平的表达，但通常只持续几天（,24-72,小时）。,稳定转染：外源,DNA,可以整合到细胞的染色体中，通常需要经过反复筛选才能得到稳定转染的同源细胞系。,转染对细胞的要求：,细胞生长状态决定了基因转染效率。如为贴壁生长的细胞，一般要求在转染前一日，重新接种于培养皿或瓶，细胞密度以铺满培养器皿的,60%,为宜；转染当日，在转染前,4,小时换新鲜培养液。对于悬浮细胞，也需在转染前,4,小时换新鲜培养液。,转染对,DNA,的要求：,用于转染的质粒,DNA,必须无蛋白质，无,RNA,和其了化学物质的污染，,OD260/280,比值应在,1.8,以上。,报告基因编码的蛋白质非常容易被鉴定，因此常,被用来检测目的基因表达的情况。,常用的报告基因系统,:,半乳糖苷酶报告系统,荧光素酶报告系统,荧光蛋白报告系统,关于荧光蛋白,Aequorea victoria,水母,GFP,subcellular localization,带标签的重组蛋白,Recombinant protein,RFP-tag,GFP-tag,co-localization,Protein1.,Protein2.,mRFP-H2B,GFP-B23,GFP-SENP3,RFP-B23,关于,GFP,载体,实验材料,HO8910,：人卵巢癌细胞系,转染质粒：,pEGFP-N1,载体，带有荧光蛋白基因的空质粒。,脂质体：,HilyMax阳离子脂质体,，可应用于转染贴壁,或悬浮细胞的瞬转及稳转，适用于含血清的培养基，,细胞毒性低，效率高且稳定，也能用于转染,siRNA,。,转染培养液：,Opti,-MEM,，营养条件较好的无血清培养液，在含血清培养液中生长的大多数细胞都能转移到,Opti,-MEM,中。,转染实验操作注意事项,1.,进入细胞培养室前带上口罩,2.,操作前用,75%,酒精消毒双手,3.,操作在超净台内进行,4.,根据需要选择合适的移液枪,5.,做好标记,超净台,移液枪,移液枪枪头,传代,(passage,subculture),：,当细胞在培养容器中增殖到一定密度，生存空间及营养物质缺乏，需按一定比例分离，接种至新的培养容器并更新培养液，这个过程称为细胞传代。,一代,:,细胞接种后到下一次传代的一段时间；可增殖几次。,培养细胞一代的三个阶段：潜伏期、指数增生期、平台期,实验研究多在指数增长期进行,细胞的传代培养,传代培养的实验原理,:,传代培养是组织培养常规保种方法之一,也是几乎所有细胞生物学实验的基础。传代要在严格的无菌条件下进行，每一步都需要认真仔细的无菌操作。,(,本次实验因条件限制，只能在一个模拟的环境下进行实验,),贴壁细胞消化后的应用：,1.,继续传代培养,2.,计数、计算细胞活力，了解细胞的生长状况。,3.,制备细胞悬液，以备后期的继续实验。（重新铺板，,MTT,实验；标记、流式分析、分选；爬片、免疫荧光；电转；提取和分离；洗涤、动物注射等）。,肿瘤细胞株的传代,悬浮细胞的传代：离心或更新培养液,贴壁细胞的传代：消化法（,0.25%,胰酶,+0.66mM EDTA),应用计数板或活力检测仪,3.,细胞计数,（,Counting),细胞活力检测,（,0.4%trypan blue,拒染）,细胞的传代和计数的实验步骤,1,倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代。,2,吸去培养皿中原有的细胞培养液,3,培养皿中加入,1-2 mL,高压灭菌过的,PBS,，以洗去培养液的残留（培养液中的血清会抑制胰酶的消化作用）。洗涤可进行,1,2,次。,4,吸去,PBS,，加入,400l 0.125,0.25,的胰蛋白酶，盖上盖子，轻轻摇晃，使胰酶能均匀地作用于所有皿底的细胞。室温或,37C,放置,1,2,分钟，倒置显微镜下观察，当观察到细胞收回突起变圆时立即加入,800l,的含血清的新鲜培养基（可,37,预热），终止胰酶的作用，经反复吹打，制成细胞悬液。,5,细胞悬液制成后，即可进行传代。传代可按照,1,传,2,或者,1,传,3,等比例进行，也可在完成计数后，按一定的细胞量进行传代。细胞计数时，如果悬液的细胞密度过大，需先按一定比例稀释后，再进行计数。通过细胞计数还可计算出细胞的活力。以稀释,10,倍为例，取,10l,细胞悬液，加入到装有,40l PBS,的,Ependorf,管中，再加入,50l 0.4%,台盼蓝溶液，混匀后吸出,10l,加到计数板上进行一次计数，最终的细胞数要乘以,10,。另外，悬液也可收集到管中，离心后用,PBS,洗涤。,完成,3,次细胞计数，计算细胞总数、活细胞数、细胞活力。,将,2.5,10,4,个活细胞传,35mm,的培养皿。,台盼蓝,0.4%,染色法计数活细胞,实验结果和记录,一、每个实验组实验结果记录表格,实验组（,2.1,）,计数,1,2,3,细胞,总数,活细胞数,细胞活力,平均活力,二、绘制细胞存活曲线（略）,倒置荧光显微镜,荧光显微镜的原理、构造,荧光显微镜与普通光学显微镜不同，它不是通过普通光源的照明观察标本，而是利用一定波长的光,(,通常是紫外光、蓝紫光,),激发显微镜下标本内的荧光物质，使之发射荧光，所以，荧光显微镜的光源所起的作用不是直接照明，而是作为一种激发标本的内荧光物质的能源。我们之所以能观察标本，是由于光源的照明，而是标本内荧光物质吸收激发的光能后所呈现的荧光现象。,由此可知，荧光显微镜的特点，主要是它的光源能供给大量特定波长范围的激发光，使受检标本内的荧光物质能获得必要强度的激发光。同时，荧光显微镜必须具备相应的滤光镜系统。,它是由超高压光源、滤片系统、光学系统和摄影系统等主要部件组成。,（,9,）荧光转盘,（,7,）荧光独立电源,（,8,）荧光光栅拉杆,（,2,）聚光器,（,3,）载物台,（,4,）物镜,（,5,）调焦操纵轮,2,3,4,5,7,8,9,徕卡,DMI3000B,倒置荧光显微镜,明 场：,1,打开右下方显微镜透射光电源（,1,）。,2,设置聚光器（,2,），若只需要普通的明场观察，将聚光器设置为“,BF”,。若需进行相差观察，按所选择的物镜放大倍数将聚光器设置为“,PH1”(10,、,20),或“,PH2”(40),。,3,将所需观察的标本置于载物台上（,3,）。,4,选择你要用的物镜（,4,）,(4,、,10,、,20,、,40),。,5,利用调焦操纵轮（,5,）聚焦和观察图像。,6,若尚需采集图像，见操作步骤,13“,图像采集操作”。,徕卡,DMI3000B,倒置显微镜操作步骤,转染实验结果观察,20X,倒置显微镜透射光图像,20X,倒置显微镜荧光图像,注意事项,:,本台电脑专用于显微镜图像采集，禁止使用未格式化的优盘拷贝文件及其他用途。,不要频繁开关荧光电源，打开后至少使用半小时才能关闭；关闭后至少半小时才能重新打开,(,确保汞灯冷却，汞灯寿命约,200,小时,),。,保持显微镜各部件,(,如载物台,),的整洁，目镜、物镜、聚光镜等光学部件表面有灰尘时，应先用洗耳球吹掉，再用擦镜纸蘸乙醚,:,乙醇,(7:3),混合液由内向外螺旋形轻轻擦拭干净。,用后关闭显微镜电源、电脑，登记使用情况。,每次使用后，应待仪器（电源、灯等）冷却，再用防尘罩盖上显微镜和附件。,