荧光探针技术测定细胞内离子浓度.ppt

荧光探针测定细胞内离子荧光探针测定细胞内离子浓度技术浓度技术陶陶 亮亮中山医学院药理教研室中山医学院药理教研室细胞内离子细胞内离子cytoplasmNa+Cl-Ca2+K+Fe2+细胞内离子的生理功能细胞内离子的生理功能细胞结构的组成成分细胞结构的组成成分 血红蛋白中血红蛋白中Fe2+、超氧化物歧化酶中、超氧化物歧化酶中Cu2+维持细胞膜电位维持细胞膜电位 K+、Cl-、Na+、Ca2+维持胞内外渗透压维持胞内外渗透压 Na+协同转运葡萄糖等营养物质协同转运葡萄糖等营养物质排泄排泄代谢产物代谢产物细胞内离子浓度异常与疾病细胞内离子浓度异常与疾病细胞内细胞内Ca2+异常与疾病异常与疾病高血压高血压骨质疏松骨质疏松癫痫癫痫细胞内细胞内Na+异常与疾病异常与疾病心律失常心律失常猝死猝死细胞内细胞内K K+异常与疾病异常与疾病惊厥惊厥阵发性舞蹈手足徐动症阵发性舞蹈手足徐动症细胞内离子浓度测定意义细胞内离子浓度测定意义 预防疾病的发生预防疾病的发生预防疾病的发生预防疾病的发生 提高疾病诊断的准确性提高疾病诊断的准确性提高疾病诊断的准确性提高疾病诊断的准确性 增强治疗疗效增强治疗疗效增强治疗疗效增强治疗疗效常用细胞内离子浓度测定方法常用细胞内离子浓度测定方法常用测定方法常用测定方法原子吸收光谱法原子吸收光谱法 微量金属元素的测定：微量金属元素的测定：NaNa、K K、Ca Ca2+2+化学滴定法化学滴定法 有机化合物与离子可产生颜色变化有机化合物与离子可产生颜色变化 如如：CaCa2+2+可使铬黑可使铬黑T T由蓝变红，使钙盐指示剂由蓝变红，使钙盐指示剂 钙红从蓝变为酒红。钙红从蓝变为酒红。放射性标记法放射性标记法放射性标记目标离子，如放射性标记目标离子，如4545CaCa微电极法微电极法荧光探针荧光探针荧光探针荧光探针法法法法 其他新技术其他新技术核磁共振法核磁共振法核磁共振法核磁共振法NMRNMR不同脲素浓度下,通过监测1H,15N信号强度变化监控 MMP-12 折叠过程其他新技术其他新技术生物芯片技术生物芯片技术生物芯片技术生物芯片技术荧光强度反应荧光标记抗体与相应抗原结合程度荧光强度反应荧光标记抗体与相应抗原结合程度Luis A.Rivas,et.al.A 200-Antibody Microarray Biochip for Environmental Monitoring:Searching for Universal Microbial Biomarkers through Immunoprofiling荧光探针荧光探针荧光：某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光量子后，其原子荧光：某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光量子后，其原子中的电子被激发到较高的能级，从而产生吸收光谱，有些物质，当中的电子被激发到较高的能级，从而产生吸收光谱，有些物质，当用紫外线照射时，它吸收了某种波长的光后还会发射处各种颜色和用紫外线照射时，它吸收了某种波长的光后还会发射处各种颜色和不同强度的光，而当紫外线停止照射后，这种光也随之消失，这种不同强度的光，而当紫外线停止照射后，这种光也随之消失，这种光称之为荧光。光称之为荧光。分类：自发性荧光：组织在短波长光照射下自行发射出的荧光，如分类：自发性荧光：组织在短波长光照射下自行发射出的荧光，如组织中蛋白质和酯类在紫外线照射下发出微弱的淡蓝色荧光；组织中蛋白质和酯类在紫外线照射下发出微弱的淡蓝色荧光；诱发荧光：组织与荧光色素结合后，经一定波长的光线照射后发出诱发荧光：组织与荧光色素结合后，经一定波长的光线照射后发出的荧光的荧光荧光探针：常用的诱发荧光，能产生荧光的生物染色剂称之为荧光荧光探针：常用的诱发荧光，能产生荧光的生物染色剂称之为荧光染料或荧光探针染料或荧光探针荧光探针技术的应用荧光探针技术的应用pH测定测定Guoliang Ke,et.al.A Cell-Surface-Anchored Ratiometric Fluorescent Probe for Extracellular pH SensingpHpH在在6.0-8.06.0-8.0时，不同时，不同pHpH值，荧光探针具有不同荧光强度值，荧光探针具有不同荧光强度细胞间通讯细胞间通讯GJICGJIC检测检测标记活细胞线粒体标记活细胞线粒体线粒体荧光探针线粒体荧光探针线粒体荧光探针线粒体荧光探针骨架蛋白骨架蛋白骨架蛋白骨架蛋白MergeMergeAbhik Mallick,et.al.Dual Drug Conjugated Nanoparticle for Simultaneous Targeting of Mitochondria and Nucleus in Cancer Cells DNA标记标记通过通过通过通过X XRayRay检测口服有机硅修饰检测口服有机硅修饰检测口服有机硅修饰检测口服有机硅修饰PIPI荧光探针的口服吸收过程荧光探针的口服吸收过程荧光探针的口服吸收过程荧光探针的口服吸收过程Michihiro Nakamura,et.al.Thiol-Organosilica Particles Internally Functionalized with Propidium Iodide as a Multicolor Fluorescence and X ray Computed Tomography Probe and Application for Non-Invasive Functional Gastrointestinal Tract Imaging细胞膜电位检测细胞膜电位检测Jihoon Kim,et.al.Rapid Cytotoxicity Screening Platform for Amyloid Inhibitors Using a Membrane-Potential Sensitive Fluorescent Probe细胞凋亡时，膜电位改变，膜结合荧光探针的强度反应细胞凋亡程度细胞凋亡时，膜电位改变，膜结合荧光探针的强度反应细胞凋亡程度细胞凋亡时，膜电位改变，膜结合荧光探针的强度反应细胞凋亡程度细胞凋亡时，膜电位改变，膜结合荧光探针的强度反应细胞凋亡程度荧光探针技术测定过程荧光探针技术测定过程荧光探针的负载荧光探针的负载荧光探针的负载荧光探针的负载荧光探针与目的离子结合荧光探针与目的离子结合荧光探针与目的离子结合荧光探针与目的离子结合荧光强度检测：荧光显微镜、流式细胞术、双波长荧光光度计荧光强度检测：荧光显微镜、流式细胞术、双波长荧光光度计荧光强度检测：荧光显微镜、流式细胞术、双波长荧光光度计荧光强度检测：荧光显微镜、流式细胞术、双波长荧光光度计荧光探针应用条件荧光探针应用条件负载：探针必须局限于要测定离子浓度的区域，最常见负载：探针必须局限于要测定离子浓度的区域，最常见负载：探针必须局限于要测定离子浓度的区域，最常见负载：探针必须局限于要测定离子浓度的区域，最常见 的部位是细胞液，但有时为线粒体；的部位是细胞液，但有时为线粒体；的部位是细胞液，但有时为线粒体；的部位是细胞液，但有时为线粒体；校准：探针的荧光强度必须与游离离子浓度定量相关校准：探针的荧光强度必须与游离离子浓度定量相关校准：探针的荧光强度必须与游离离子浓度定量相关校准：探针的荧光强度必须与游离离子浓度定量相关荧光探针的负载荧光探针的负载大量负载：大量负载：大量负载：大量负载：AMAM酯负载酯负载酯负载酯负载 酸负载酸负载酸负载酸负载 ATPATP诱导渗透诱导渗透诱导渗透诱导渗透 阳离子脂质体递送阳离子脂质体递送阳离子脂质体递送阳离子脂质体递送 电穿孔电穿孔电穿孔电穿孔 低渗休克低渗休克低渗休克低渗休克单细胞负载单细胞负载单细胞负载单细胞负载 显微注射法显微注射法显微注射法显微注射法 膜片钳技术膜片钳技术膜片钳技术膜片钳技术 微量电泳法微量电泳法微量电泳法微量电泳法 压力注射压力注射压力注射压力注射法法法法荧光探针的负载 AM酯负载AMAM负载技术：负载技术：负载技术：负载技术：CaCa2+2+及其它阳离子探针的羧基和及其它阳离子探针的羧基和及其它阳离子探针的羧基和及其它阳离子探针的羧基和PHPH探针的探针的探针的探针的酚酚酚酚 羟基被分别衍生为乙酰甲酯或乙酸酯，使探针可透过细羟基被分别衍生为乙酰甲酯或乙酸酯，使探针可透过细羟基被分别衍生为乙酰甲酯或乙酸酯，使探针可透过细羟基被分别衍生为乙酰甲酯或乙酸酯，使探针可透过细胞膜并对离子不敏感，一旦进入细胞内，这些衍生的探针胞膜并对离子不敏感，一旦进入细胞内，这些衍生的探针胞膜并对离子不敏感，一旦进入细胞内，这些衍生的探针胞膜并对离子不敏感，一旦进入细胞内，这些衍生的探针就可被普遍存在的细胞内酯酶水解，释放出离子敏感的多就可被普遍存在的细胞内酯酶水解，释放出离子敏感的多就可被普遍存在的细胞内酯酶水解，释放出离子敏感的多就可被普遍存在的细胞内酯酶水解，释放出离子敏感的多阴离子探针阴离子探针阴离子探针阴离子探针不足：不足：不足：不足：区室化：细胞内膜包结构聚集区室化：细胞内膜包结构聚集区室化：细胞内膜包结构聚集区室化：细胞内膜包结构聚集 AMAM酯不完全水解酯不完全水解酯不完全水解酯不完全水解 渗漏：有机离子载体、渗漏：有机离子载体、渗漏：有机离子载体、渗漏：有机离子载体、P P糖蛋白多药载体等排除胞外糖蛋白多药载体等排除胞外糖蛋白多药载体等排除胞外糖蛋白多药载体等排除胞外荧光探针的负载 AM酯负载离解常数离解常数离解常数离解常数K Kd d：将荧光信号转化为离子信号的关键转换参数：将荧光信号转化为离子信号的关键转换参数：将荧光信号转化为离子信号的关键转换参数：将荧光信号转化为离子信号的关键转换参数校准过程：记录对应于精确控制的离子浓度的荧光信号，校准过程：记录对应于精确控制的离子浓度的荧光信号，校准过程：记录对应于精确控制的离子浓度的荧光信号，校准过程：记录对应于精确控制的离子浓度的荧光信号，通过换算计算出解离常数通过换算计算出解离常数通过换算计算出解离常数通过换算计算出解离常数K Kd d，荧光探针的校准荧光探针技术检测荧光探针技术检测Ca2+Ca2+荧光探针分类荧光探针分类紫外光激发的荧光紫外光激发的荧光紫外光激发的荧光紫外光激发的荧光CaCa2+2+探针探针探针探针可见光激发的荧光可见光激发的荧光可见光激发的荧光可见光激发的荧光CaCa2+2+探针探针探针探针荧光荧光荧光荧光CaCa2+2+探针交联物探针交联物探针交联物探针交联物生物性发光生物性发光生物性发光生物性发光CaCa2+2+探针探针探针探针紫外光激发的荧光Ca2+探针高亲和力的钙探针：高亲和力的钙探针：高亲和力的钙探针：高亲和力的钙探针：Fura-2,Fura-2,Indo-1Indo-1及其衍生物及其衍生物及其衍生物及其衍生物 Fura-2 Fura-2成像显微镜首选成像显微镜首选成像显微镜首选成像显微镜首选 I I I Indo-1ndo-1流式细胞术首选流式细胞术首选流式细胞术首选流式细胞术首选中等亲和力的钙探针：中等亲和力的钙探针：中等亲和力的钙探针：中等亲和力的钙探针：Fura-4F Fura-4F、Fura-5FFura-5F、Fura-6FFura-6F、FuraFura-FF-FF、Indo-5FIndo-5F低亲和力的钙探针：低亲和力的钙探针：低亲和力的钙探针：低亲和力的钙探针：BTC BTCBTCBTC-AMAM，Mag-Fura-2Mag-Fura-2、Mag-Fura-5Mag-Fura-5、Mag-Indo-1Mag-Indo-1金鸡纳皮素（金鸡纳皮素（金鸡纳皮素（金鸡纳皮素（QuinQuin）-2-2和和和和Quin-2 AMQuin-2 AM 吸收率和量子产率比低，主要用来耗竭胞质液中游离吸收率和量子产率比低，主要用来耗竭胞质液中游离吸收率和量子产率比低，主要用来耗竭胞质液中游离吸收率和量子产率比低，主要用来耗竭胞质液中游离CaCa2+2+，确保，确保，确保，确保单向性单向性单向性单向性CaCa2+2+内流内流内流内流 可见光激发的荧光Ca2+探针 高亲和力的钙探针：高亲和力的钙探针：高亲和力的钙探针：高亲和力的钙探针：Fluo-3Fluo-3、FluoFluo-4 4 4 4、R R R Rhodhod-2 2 2 2和相关的衍生物和相关的衍生物和相关的衍生物和相关的衍生物 基于基于基于基于Fluo-3Fluo-3和和和和R R R Rhodhod-2 2 2 2的低亲和力的钙探针：的低亲和力的钙探针：的低亲和力的钙探针：的低亲和力的钙探针：Fluo-5FFluo-5F、Fluo-4FFFluo-4FF、Fluo-5NFluo-5N、Mag-Fluo-4Mag-Fluo-4、R R R Rhodhod-5 5 5 5N N 钙绿钙绿钙绿钙绿CalciumCalcium GreenGreen、钙橙、钙橙、钙橙、钙橙CalciumCalcium OrangeOrange、钙深红、钙深红、钙深红、钙深红CalciumCalcium CrimsonCrimson探针探针探针探针 F F F Furaura RedRed探针探针探针探针 钙黄绿素钙黄绿素钙黄绿素钙黄绿素CalceinCalcein荧光Ca2+探针交联物葡聚糖交联物：葡聚糖交联物：葡聚糖交联物：葡聚糖交联物：FuraFura、Fluo-4Fluo-4和和和和IndoIndo葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖水溶性，低毒性，无生物活性水溶性，低毒性，无生物活性水溶性，低毒性，无生物活性水溶性，低毒性，无生物活性抵抗内源性糖苷酶的裂解抵抗内源性糖苷酶的裂解抵抗内源性糖苷酶的裂解抵抗内源性糖苷酶的裂解极少区室化极少区室化极少区室化极少区室化很好的存在于活细胞内很好的存在于活细胞内很好的存在于活细胞内很好的存在于活细胞内亲脂性衍生物：亲脂性衍生物：亲脂性衍生物：亲脂性衍生物：Fura-CFura-C1818、Fura-FF-CFura-FF-C1818和钙绿和钙绿和钙绿和钙绿-C-C1818与膜表面结合，检测局部浓度变化与膜表面结合，检测局部浓度变化与膜表面结合，检测局部浓度变化与膜表面结合，检测局部浓度变化生物性发光Ca2+探针水母素、重组水母素及其衍生物水母素、重组水母素及其衍生物水母素、重组水母素及其衍生物水母素、重组水母素及其衍生物从发光的水母和其他海洋生物中分离得到的发光蛋白从发光的水母和其他海洋生物中分离得到的发光蛋白从发光的水母和其他海洋生物中分离得到的发光蛋白从发光的水母和其他海洋生物中分离得到的发光蛋白优点：优点：优点：优点：可排除自发荧光的干扰可排除自发荧光的干扰可排除自发荧光的干扰可排除自发荧光的干扰不渗出，不分泌不渗出，不分泌不渗出，不分泌不渗出，不分泌不发生区室化或细胞内隔离不发生区室化或细胞内隔离不发生区室化或细胞内隔离不发生区室化或细胞内隔离检测长期间内检测长期间内检测长期间内检测长期间内CaCa2+2+变化变化变化变化Fluo-4荧光探针检测Ca2+Bright-FieldFluo-4 fluorescence MergeChenye Yang,et.al.Continuous Fluorescence Imaging of Intracellular Calcium by Use of Ion-Selective Nanospheres with Adjustable Spectra 荧光探针技术检测荧光探针技术检测Na+、K+及及其它离子其它离子荧光探针技术检测Na+和K+S S S SBFIBFI和和和和PBFIPBFI及其及其及其及其AMAM酯：苯并呋喃基荧光团连接到一种冠醚酯：苯并呋喃基荧光团连接到一种冠醚酯：苯并呋喃基荧光团连接到一种冠醚酯：苯并呋喃基荧光团连接到一种冠醚 螯合剂螯合剂螯合剂螯合剂S S S SBFIBFI：对：对：对：对N N N Na a+选择性强选择性强选择性强选择性强P P P PBFIBFI：对：对：对：对K K K K+选择性强选择性强选择性强选择性强 S S S SBFIBFI和和和和PBFIPBFI的应用：的应用：的应用：的应用：SBPI SBPI用于测定分离线粒体的用于测定分离线粒体的用于测定分离线粒体的用于测定分离线粒体的N N N Na a+梯度或不同组织和细胞内梯度或不同组织和细胞内梯度或不同组织和细胞内梯度或不同组织和细胞内N N N Na a+水水水水平或平或平或平或N N N Na a+外流外流外流外流 PBFI PBFI用于测定用于测定用于测定用于测定K K K K+外流与细胞凋亡间关系外流与细胞凋亡间关系外流与细胞凋亡间关系外流与细胞凋亡间关系荧光探针技术检测Na+钠绿钠绿钠绿钠绿 比比比比SBFISBFI对对对对N N N Na a+的选择性更高的选择性更高的选择性更高的选择性更高 激发波长激发波长激发波长激发波长488nm488nm，可替代，可替代，可替代，可替代ConfocalConfocal和流式细胞仪进行检测和流式细胞仪进行检测和流式细胞仪进行检测和流式细胞仪进行检测 对细胞光损伤小对细胞光损伤小对细胞光损伤小对细胞光损伤小应用：应用：应用：应用：评估大鼠丘脑神经元持续评估大鼠丘脑神经元持续评估大鼠丘脑神经元持续评估大鼠丘脑神经元持续N N N Na a+蓄积蓄积蓄积蓄积 检测缺氧诱导的神经元检测缺氧诱导的神经元检测缺氧诱导的神经元检测缺氧诱导的神经元N N N Na a+内流内流内流内流荧光探针技术检测Na+C C C CorooroN N N Na a RedRed C C C CorooroN N N Na a RedRed氯化物氯化物氯化物氯化物 细胞通透性酯细胞通透性酯细胞通透性酯细胞通透性酯 对对对对N N N Na a+高选择性高选择性高选择性高选择性应用：应用：应用：应用：对细胞的对细胞的对细胞的对细胞的N N N Na a+内流产生敏感反应内流产生敏感反应内流产生敏感反应内流产生敏感反应 测定培养的上皮细胞和人肺组织气管气道表面液体测定培养的上皮细胞和人肺组织气管气道表面液体测定培养的上皮细胞和人肺组织气管气道表面液体测定培养的上皮细胞和人肺组织气管气道表面液体SBFI荧光探针技术检测Na+Christophe M.Lamy,et.al.Sodium Sensing in Neurons with a Dendrimer-Based Nanoprobe ControlTTXTTXTTX阻断阻断阻断阻断N Na a+通道，通道，通道，通道，N Na a+荧光探针标记荧光探针标记荧光探针标记荧光探针标记N Na a+，膜，膜，膜，膜N Na a+电位紊乱电位紊乱电位紊乱电位紊乱荧光探针技术检测其它离子荧光荧光荧光荧光ClCl探针：探针：探针：探针：6-6-甲氧基喹啉衍生物甲氧基喹啉衍生物甲氧基喹啉衍生物甲氧基喹啉衍生物SPQSPQ 检测原理：经扩散限制的碰撞淬灭检测原理：经扩散限制的碰撞淬灭检测原理：经扩散限制的碰撞淬灭检测原理：经扩散限制的碰撞淬灭 应用：应用：应用：应用：用于检测用于检测用于检测用于检测CFTRCFTR活性活性活性活性 其他转运蛋白，如其他转运蛋白，如其他转运蛋白，如其他转运蛋白，如GABAGABAA A、红细胞、红细胞、红细胞、红细胞ClClHCOHCO3 3交换器等交换器等交换器等交换器等荧光探针技术检测其他离子荧光探针技术检测其他离子荧光探针技术检测其他离子荧光探针技术检测其他离子 氰化物氰化物氰化物氰化物 硫化物、亚硫酸根、硫酸根、硫代硫酸根硫化物、亚硫酸根、硫酸根、硫代硫酸根硫化物、亚硫酸根、硫酸根、硫代硫酸根硫化物、亚硫酸根、硫酸根、硫代硫酸根 亚硝酸根、硝酸跟和一氧化氮亚硝酸根、硝酸跟和一氧化氮亚硝酸根、硝酸跟和一氧化氮亚硝酸根、硝酸跟和一氧化氮 磷酸根和焦磷酸根磷酸根和焦磷酸根磷酸根和焦磷酸根磷酸根和焦磷酸根 硒硒硒硒荧光探针技术检测荧光探针技术检测p pH H荧光探针技术检测pH细胞内胞质液细胞内胞质液细胞内胞质液细胞内胞质液p pH H常为常为常为常为6.86.87.47.4，而酸性细胞器内，而酸性细胞器内，而酸性细胞器内，而酸性细胞器内p pH H则则则则为为为为4.54.56.06.0细胞内细胞内细胞内细胞内p pH H值可部分发生改变，而且速度相当慢值可部分发生改变，而且速度相当慢值可部分发生改变，而且速度相当慢值可部分发生改变，而且速度相当慢荧光荧光荧光荧光pHpH探针可有效检测不同生理和病理过程中探针可有效检测不同生理和病理过程中探针可有效检测不同生理和病理过程中探针可有效检测不同生理和病理过程中pHpH变化变化变化变化生理范围的生理范围的生理范围的生理范围的pHpH测定测定测定测定SNARFSNARF、SNAFLSNAFL酸性细胞器的酸性细胞器的酸性细胞器的酸性细胞器的pHpH测定测定测定测定LysoSensorLysoSensor探针探针探针探针用于测定近中性pH的荧光探针荧光素黄荧光素黄荧光素黄荧光素黄 中性中性中性中性pHpH测定首选测定首选测定首选测定首选 发射波长较长发射波长较长发射波长较长发射波长较长、量子产率高量子产率高量子产率高量子产率高 易从细胞内流失易从细胞内流失易从细胞内流失易从细胞内流失荧光素黄衍生物荧光素黄衍生物荧光素黄衍生物荧光素黄衍生物BCECFBCECF 2,7-2,7-二二二二(2-2-羧乙基羧乙基羧乙基羧乙基)-5(6)-5(6)-羧基荧光素羧基荧光素羧基荧光素羧基荧光素 不易透过细胞膜不易透过细胞膜不易透过细胞膜不易透过细胞膜 pKapKa=6.98,=6.98,更适于生理条件下更适于生理条件下更适于生理条件下更适于生理条件下pHpH的测定的测定的测定的测定SNAFLsSNAFLs半萘酚荧光素类半萘酚荧光素类半萘酚荧光素类半萘酚荧光素类 pKapKa在在在在7 7 7 7.6.67.97.9范围内均发生漂移范围内均发生漂移范围内均发生漂移范围内均发生漂移,可用比率法测定体系的可用比率法测定体系的可用比率法测定体系的可用比率法测定体系的p H p H 值值值值 SNAFLs半萘酚荧光素类共轭程度更大共轭程度更大,其吸收波长也更长其吸收波长也更长酸性pH使用的探针LysoSensorLysoSensor探针探针探针探针与生物大分子共价结合，通过细胞固有机制主动摄取与生物大分子共价结合，通过细胞固有机制主动摄取与生物大分子共价结合，通过细胞固有机制主动摄取与生物大分子共价结合，通过细胞固有机制主动摄取检测酸性细胞器，追踪酸性细胞器运输检测酸性细胞器，追踪酸性细胞器运输检测酸性细胞器，追踪酸性细胞器运输检测酸性细胞器，追踪酸性细胞器运输俄勒冈绿和二氯荧光黄衍生物俄勒冈绿和二氯荧光黄衍生物俄勒冈绿和二氯荧光黄衍生物俄勒冈绿和二氯荧光黄衍生物荧光探针技术检测pH不同不同pHpH条件下，荧光探针条件下，荧光探针CN-pHCN-pH荧光强度不同，荧光强度不同，测定荧光强度可计算出相应的测定荧光强度可计算出相应的pHpH值值Baoli Dong,et.al.Dual Site-Controlled and Lysosome-Targeted Intramolecular Charge TransferPhotoinduced Electron TransferFluorescence Resonance Energy Transfer Fluorescent Probe for Monitoring pH Changes in Living Cells 荧光探针强度检测方法的选择 激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜 流式细胞仪流式细胞仪 双波长荧光光度计双波长荧光光度计激光共聚焦显微镜（LSCM）LSCM探针选择荧光探针与研究的结构有密切关系荧光探针与研究的结构有密切关系荧光探针与研究的结构有密切关系荧光探针与研究的结构有密切关系选择荧光强度较强的探针选择荧光强度较强的探针选择荧光强度较强的探针选择荧光强度较强的探针同时应用多种荧光探针时，避免发射光谱重叠同时应用多种荧光探针时，避免发射光谱重叠同时应用多种荧光探针时，避免发射光谱重叠同时应用多种荧光探针时，避免发射光谱重叠荧光探针溶剂对荧光强度无影响荧光探针溶剂对荧光强度无影响荧光探针溶剂对荧光强度无影响荧光探针溶剂对荧光强度无影响如组织需固定，选择耐受固定剂的荧光探针如组织需固定，选择耐受固定剂的荧光探针如组织需固定，选择耐受固定剂的荧光探针如组织需固定，选择耐受固定剂的荧光探针荧光信号的检测GmGm促进促进促进促进RhodRhod2 2标记的标记的标记的标记的CaCa2+2+向胞浆转移向胞浆转移向胞浆转移向胞浆转移Edgar J.Paredes-Gamero,et.al.Cell Permeable Gomesin Peptide Promotes Cell Death by Intracellular Ca2+Overload 流式细胞仪荧光探针的选择荧光信号检测Wan-Kyu Oh,et.al.Fluorescent Polymer Nanoparticle for Selective Sensing of Intracellular Hydrogen Peroxide 检测检测检测检测FITC-PANFITC-PAN标记的标记的标记的标记的H H2 2OO2 2的释放量的释放量的释放量的释放量双波长荧光光度法双波长荧光光度法应用条件应用条件应用条件应用条件：a)a)干扰组分在该两干扰组分在该两干扰组分在该两干扰组分在该两波长处的吸光度相波长处的吸光度相波长处的吸光度相波长处的吸光度相同同同同 b)b)被测组分在该两被测组分在该两被测组分在该两被测组分在该两波长的吸光度差波长的吸光度差波长的吸光度差波长的吸光度差 A A要足够大要足够大要足够大要足够大双波长荧光光度法测定Ca2+原理：原理：原理：原理：荧光探针：荧光探针：荧光探针：荧光探针：第一代：第一代：第一代：第一代：quin-2 quin-2 quin-2 quin-2 第二代：第二代：第二代：第二代：Fura-2Fura-2Fura-2Fura-2 用于双波长荧光示踪测定用于双波长荧光示踪测定用于双波长荧光示踪测定用于双波长荧光示踪测定CaCaCaCa2+2+2+2+i i i i 第三代：第三代：第三代：第三代：Fluo-3 Fluo-3 Fluo-3 Fluo-3 用于激光光聚焦显微镜测定用于激光光聚焦显微镜测定用于激光光聚焦显微镜测定用于激光光聚焦显微镜测定CaCaCaCa2+2+2+2+i i i iFura-2Fura-2有二种形式有二种形式有二种形式有二种形式Fura-2 Fura-2 游离形式，不能透过细胞膜，可与游离形式，不能透过细胞膜，可与游离形式，不能透过细胞膜，可与游离形式，不能透过细胞膜，可与CaCa2+2+结合；结合；结合；结合；激发峰值激发峰值激发峰值激发峰值:380nm:380nm，与，与，与，与CaCa2+2+结合后结合后结合后结合后 340nm340nmFura-2/AM Fura-2/AM 酯化形式，可以透过细胞膜，酯化形式，可以透过细胞膜，酯化形式，可以透过细胞膜，酯化形式，可以透过细胞膜，不能与不能与不能与不能与CaCa2+2+结合结合结合结合Fura-2/AM Fura-2/AM 进入细胞进入细胞进入细胞进入细胞 水解形成水解形成水解形成水解形成Fura-2Fura-2Fura-2-CaFura-2-Ca2+2+Ca+Ca2+2+激发峰值激发峰值激发峰值激发峰值 380nm 380nm340nm340nm酯酶酯酶酯酶酯酶CaCaCaCa2+2+2+2+i i i i =KdKd (F(FF Fminmin)/()/(F FmaxmaxF)F)K Kd d:Fura-2:Fura-2与与与与CaCa2+2+反应的解离常数，生理条件下反应的解离常数，生理条件下反应的解离常数，生理条件下反应的解离常数，生理条件下=224nmol/L=224nmol/L F:F:实验记录到的荧光比值（实验记录到的荧光比值（实验记录到的荧光比值（实验记录到的荧光比值（F F340340/F/F380380）F Fmaxmax ：最大荧光值：加：最大荧光值：加：最大荧光值：加：最大荧光值：加CaCa2+2+载体将细胞外载体将细胞外载体将细胞外载体将细胞外CaCa2+2+载入细胞测得载入细胞测得载入细胞测得载入细胞测得F Fminmin ：最小荧光值：加螯合剂使：最小荧光值：加螯合剂使：最小荧光值：加螯合剂使：最小荧光值：加螯合剂使CaCaCaCa2+2+2+2+i i i i为为为为“0 0 0 0”时测得时测得时测得时测得结果计算：结果计算：结果计算：结果计算：双波长荧光光度法测定Ca2+制备细胞悬液制备细胞悬液制备细胞悬液制备细胞悬液Fura-2Fura-2负载：加入溶于负载：加入溶于负载：加入溶于负载：加入溶于DMSODMSO的的的的Fura-2Fura-2AMAM，3737摄氏度恒温振荡摄氏度恒温振荡摄氏度恒温振荡摄氏度恒温振荡30-45min30-45min，负载后的细胞以含，负载后的细胞以含，负载后的细胞以含，负载后的细胞以含0.2%BSA0.2%BSA的的的的HanksHanks液洗液洗液洗液洗2 2次。次。次。次。双波长荧光光度计测定：测定条件双波长荧光光度计测定：测定条件双波长荧光光度计测定：测定条件双波长荧光光度计测定：测定条件激发光光栅激发光光栅激发光光栅激发光光栅5nm5nm，发射光光，发射光光，发射光光，发射光光栅栅栅栅10nm10nm，以，以，以，以300-420nm300-420nm扫描激发光谱。如峰值在扫描激发光谱。如峰值在扫描激发光谱。如峰值在扫描激发光谱。如峰值在340nm340nm，表明，表明，表明，表明Fura-2Fura-2已负载入细胞内，然后固定激发波长在高峰波长，观察不同已负载入细胞内，然后固定激发波长在高峰波长，观察不同已负载入细胞内，然后固定激发波长在高峰波长，观察不同已负载入细胞内，然后固定激发波长在高峰波长，观察不同实验条件下荧光强度的变化实验条件下荧光强度的变化实验条件下荧光强度的变化实验条件下荧光强度的变化总总 结结根据检测目的离子，选择特异性荧光探针；根据检测目的离子，选择特异性荧光探针；根据检测目的离子，选择特异性荧光探针；根据检测目的离子，选择特异性荧光探针；根据所选择荧光探针，选择相应的检测方法；根据所选择荧光探针，选择相应的检测方法；根据所选择荧光探针，选择相应的检测方法；根据所选择荧光探针，选择相应的检测方法；提高荧光探针的负载率；提高荧光探针的负载率；提高荧光探针的负载率；提高荧光探针的负载率；谢谢 谢！谢！