DB21∕T 2592.3-2016 鸡传染性疾病检测方法 第3部分：鸡马立克氏病毒实时荧光PCR检测方法.pdf

ICS 11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 2592.32016 鸡传染性疾病检测方法 第 3 部分：鸡马立克氏病毒实时荧光 PCR检测方法 Detection method of chicken infectious disease Part3:The testing method of real-time fluorescent PCR for chicken Mareks disease 2016 - 03 - 18 发布 2016 - 05 - 18 实施辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 2592.32016 I 目 次 前言 . II 1 范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 缩略语 . 1 4 仪器与器材 . 1 4.1 仪器 . 1 4.2 器材 . 1 5 试剂和材料 . 2 6 操作步骤 . 2 6.1 样品的采集、存放和运送 . 2 6.1.1 采样工具 . 2 6.1.2 样品的采集 . 2 6.1.3 存放与运送 . 2 6.2 实时荧光 PCR 检测 . 3 6.2.1 DNA 提取. 3 6.2.2 扩增体系的配制 . 3 6.2.3 加样 . 3 6.2.4 荧光 PCR 扩增检测 . 3 7 结果判定 . 3 7.1 阈值设定 . 3 7.2 质控标准 . 4 7.3 结果描述及判定 . 4 附录 A（规范性附录） 磷酸盐缓冲生理盐水配方. 5 DB21/T 2592.32016 II 前 言 标准鸡传染性疾病检测方法按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 标准鸡传染性疾病检测方法分为三个部分： 鸡传染性法氏囊病毒实时荧光RT-PCR检测方法 鸡传染性支气管炎病毒荧光RT-PCR检测方法 鸡马立克氏病毒实时荧光PCR检测方法 本部分为标准鸡传染性疾病检测方法的第3部分 本部分由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本部分由辽宁省畜牧兽医局归口。 本部分起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本部分主要起草人：王宏燕、曹东、闫海滨、石霖、赵培、何欣、薛树山、齐德林、李井春、马建山、姚伟、孙洪志DB21/T 2592.32016 1 鸡传染性疾病检测方法 第3部分：鸡马立克氏病毒实时荧光PCR检测方法 1 范围 本标准规定了鸡马立克氏病毒（Mareks disease virus，MDV）实时荧光PCR检测方法的实验技术要求。 本标准适用于鸡马立克氏病毒的检测和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 中华人民共和国农业部公告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 MDV：鸡马立克氏病毒（Mareks disease virus） Ct值：循环阈值（cycle threshold） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） 实时荧光PCR：实时荧光聚合酶链式反应（real-time fluorescent polymerase chain reaction） PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（phosphate buffer saline ） 4 仪器与器材 4.1 仪器 4.1.1 分析天平 4.1.2 高速离心机 4.1.3 荧光 PCR 扩增仪 4.1.4 冰箱（4 ，-20 ，-70 ） 4.1.5 水浴锅 4.1.6 微量移液器（最大量程为 2 L，20 L，200 L，1000 L） 4.2 器材 4.2.1 组织匀浆器或研钵 4.2.2 眼科剪 4.2.3 眼科镊 4.2.4 刀片 4.2.5 1.5 mL 灭菌离心管 4.2.6 PCR 八联排管或 96 孔板 DB21/T 2592.32016 2 4.2.7 吸头（10 L，200 L，1000 L） 4.2.8 灭菌双蒸水 4.2.9 称量纸 5 试剂和材料 除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯。 5.1 DNAzol Reagent：DNA 抽提试剂，外观为淡绿色，于 4 8 保存。 5.2 SYBR Green试剂盒：-20 长期保存，融化后于 4 8 保存（不超过 1 个月）。 5.3 PBS：磷酸盐缓冲生理盐水（0.02 mol/L pH7.2）。 5.4 无水乙醇：-20 预冷。 5.5 75%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20 预冷。 5.6 阴性对照：灭菌双蒸水。 5.7 阳性对照：MDV 细胞培养物。 6 操作步骤 6.1 样品的采集、存放和运送 6.1.1 采样工具 15 mL 离心管和 1.5 mL 离心管经 121 2 高压灭菌 15 min；眼科剪、眼科镊、组织匀浆器或研钵、刀片经 160 干热灭菌 2 h。 6.1.2 样品的采集 6.1.2.1 组织样品的采集 采取病鸡或活鸡的肝脏、肾脏和脾脏等组织，装入灭菌 15mL 离心管中，编号，送实验室。取 100 mg 左右待检样品，按 1:5 倍体积加入 PBS，于研钵或组织匀浆器中充分研磨，1000 g 离心 15 min，取上清液，转入 1.5 mL 离心管中编号备用。 6.1.2.2 皮肤的采集 皮肤要选病变明显部分的边缘，采取少许放入1.5 mL离心管中送检，编号备用。 6.1.2.3 羽毛的采集 羽毛选病变明显部分，用刀片刮取羽毛及根部的皮屑少许，放入1.5 mL离心管中编号备用。 6.1.2.4 细胞培养物的采集 将产生马立克氏病毒蚀斑的细胞培养物冻融3次，转入1.5 mL离心管中编号备用。 6.1.3 存放与运送 采集的样品在 2 8 条件下保存应不超过 24 h；若需长期保存，应放置-70 冰箱，但应避免反复冻融（冻融不超过 3 次）。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在 6 h8 h 之内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品生物安全标识。 DB21/T 2592.32016 3 6.2 实时荧光 PCR 检测 6.2.1 DNA 提取 在核酸提取室进行。 6.2.1.1 取 n 个灭菌的 1.5 mL 离心管， 其中 n 为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行编号。 6.2.1.2 每管加入 800 L DNAzol，分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各 200 L，颠倒 10 次混匀，室温静置 5 min；4 10000 g 离心 10 min。 6.2.1.3 取 900 L 上清， 置新的 1.5 mL 灭菌离心管中， 加入 500 L 无水乙醇， 混匀， 室温放置 3 min；4 10000 g 离心 5 min。 6.2.1.4 弃上清， 沿管壁缓缓加入 1 mL 75%乙醇， 混匀， 4 10000 g 离心 5 min。 反复洗涤两次后，将离心管倒扣于吸水纸上，自然晾干（以无乙醇味为准）。 6.2.1.5 用 20 L 灭菌双蒸水溶解沉淀，于-20 冰箱保存备用。 6.2.2 扩增体系的配制 在配液区进行。 设实时荧光PCR反应数为n， 其中n为待检样品数+阳性管数+阴性管数， 每个样本检测反应体系配制见表1，向每个荧光PCR管或96孔板孔中分装23 L的反应体系。 表1 每个样品反应体系配制表 体系组分 用量 SYBR Green 12.5L 上游引物F 0.8L 下游引物R 0.8L ROX Reference Dye（50） 0.5L 灭菌双蒸水 8.4L 总量 23L 6.2.3 加样 在样本处理区进行。在各设定的荧光PCR管或96孔板孔中加入6.2.1中制备的2 L DNA溶液。盖紧管盖，除气泡、离心。 6.2.4 荧光 PCR 扩增检测 在扩增室进行。 6.2.4.1 将 6.2.3 中离心后的 PCR 管或 96 孔板放入荧光 PCR 扩增仪内， 注意检查各反应管是否盖紧，记录样品摆放次序。 6.2.4.2 反应条件设置：95 30 s；95 10 s；65 34 s；35 个循环。 荧光信号收集设置在每次循环的退火延伸时进行。 7 结果判定 7.1 阈值设定 DB21/T 2592.32016 4 试验检测结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值直接读取检测结果，Ct值为每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整， 以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。 7.2 质控标准 7.2.1 阴性对照无 Ct 值，且无典型扩增曲线。 7.2.2 阳性对照 Ct 值应30.0，且出现扩增曲线的样本判定为可疑。可疑样本进行双孔重复试验，若任一孔或两孔重复试验结果Ct值30.0并出现典型扩增曲线者为阳性，否则为阴性。 DB21/T 2592.32016 5 A A 附 录 A （规范性附录） 磷酸盐缓冲生理盐水配方 A.1 0.02 mol/L pH7.2 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的配制 A.1.1 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO412H20）71.64 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000 mL，混匀。 A.1.2 0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠（NaH2PO42H20）31.21 g，先加适量去离子水溶解，最后定容至1000 mL，混匀。 A.1.3 量取0.2 moL/L磷酸氢二钠溶液360 mL，0.2 mol/L磷酸二氢钠溶液140 mL，称取氯化钠38 g，用无离子水溶解稀释至5000 mL，4 保存。 _