新版酶工程酶制剂制备.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,（细胞破碎）,发酵液预处理,酶液脱色,酶蛋白初步纯化与浓缩,（酶蛋白提纯与精制）,酶制剂成形。,CH 4.1,酶制剂工业提取方法,新版酶工程酶制剂制备,第1页,CH 4.1,酶制剂工业提取方法,1 细胞破碎方法,对于胞内酶提取与制备，首先要把细胞破碎，使局限在细胞内酶蛋白游离出来，惯用破碎方法有以下几个：,1.1 机械破碎法：,1.2 物理破碎法：,1.3 化学方法：,机械捣碎法：10000转/分。,研磨法：只适合于试验室小规模操作。,匀浆法：细胞破碎程度较高，规模小,。,温差破碎法：,超声波（,20,kHz）,裂解法：15-25,kHz,，,100-150,W，,0-10，3-10,min；,当前有效化学方法主要是加入表面活性剂法惯用有：特里顿,X-100,和吐温（,Tween,），,其主要是破坏细胞膜结构，增加膜通透性。此法在试验室和生产上已成功应用,新版酶工程酶制剂制备,第2页,CH 4.1,酶制剂工业提取方法,2,发酵液预处理,2.1 发酵液絮凝,发酵液首先要进行过滤除菌，在发酵液中，由菌体自溶产生细胞碎片、核酸、杂蛋白等大分子物质，使得发酵液极难过滤；在过滤前必须进行絮凝处理。,发酵液预处理惯用方法主要是在发酵液中加入絮凝剂，惯用絮凝剂有：,聚丙烯酰胺（,Polyacrylamide,）,磺化聚苯乙烯（,Polystyrene Sulfonate,）,；,絮凝剂加入，主要有以下三方面作用：,改变发酵液中悬浮粒子物理特征，如加大粒子大小，提升粒子硬度等；,使一些可溶性胶体物质变成不溶性沉淀粒子；,降低发酵液黏度。,2.2酶液脱色,这一步骤可依据酶制剂要求而定，普通工业酶制剂允许含有起源中色素，所以就不脱色；对于医用酶制剂、分析用酶等必须进行脱色处理；当前大部分工业酶制剂都要进行脱色处理过程。,惯用脱色剂有活性炭和离子交换树脂。,活性炭吸附法，操作效率较高，脱色较彻底，但在脱色同时，也有部分酶蛋白被吸附掉了；,离子交换树脂基本上在脱色同时，不吸附酶蛋白。,我国生产了一个脱色专用树脂：,通用号脱色树脂。,在弱酸性条件下，其吸附色素，而在碱性条件下便释放色素。,树脂再生方便，再生条件是：,先用,NaOH,洗脱色素，待色素洗脱洁净后，用蒸馏水洗到中性，再用5%,HCl（,二倍树脂床体积）中和树脂，再用蒸馏水洗到,pH5.0-5.5,为止。,新版酶工程酶制剂制备,第3页,CH 4.1,酶制剂工业提取方法,3,酶蛋白初步纯化与浓缩,3.1 盐析法,1 盐析基本原理：,蛋白质在水中溶解度与其所带净电荷多少呈正相关，即蛋白质极性越强，其溶解度越大，溶液中离子与蛋白质分子争夺水分，从而减弱蛋白质水合程度，降低其溶解度；,另首先，液相中离子电荷部分地中和蛋白质分子上电荷，使其净电荷降低或净电荷消失，促使蛋白质析出；,另外，溶液中盐离子引发水分子极化和定向排列降低水分活度；以上三方面作用，使可溶性蛋白在水溶液中析出。,在盐溶液里，蛋白质溶解度对数值与溶液里离子强度成线性关系，人们总结了以下经验公式：,logS=,-Ks.,S:Protein,溶解度,g/l,；,为溶液离子强度为零时,logS,，,值受蛋白质性质、盐离子种类、溶液温度和,pH,值影响；,Ks,为盐析常数，因蛋白质而性质和盐离子种类不一样而不一样；,为溶液离子强度。,2 盐析基本方法：,蛋白质盐析方法主要有以下两种：,Ks,盐析法：即蛋白质溶液,pH,值和温度固定不变，改变溶液盐浓度（离子强度），以到达沉淀蛋白作用；此法惯用盐是硫酸铵。,盐析法：是在一定离子强度下，改变溶液,pH,值和温度，以到达蛋白沉淀目标。,在实际工作中，惯用是,Ks,盐析法，利用不一样饱和度(,NH,4,),2,SO,4,浓度，这么不一样蛋白质析出沉淀(,NH,4,),2,SO,4,浓度不一样；经过这种方法可将部分杂蛋白分离出去，到达浓缩酶蛋白目标。,3 盐析曲线：,按盐析经验公式，以中性盐浓度对酶蛋白溶解度作图，得一条以下曲线：,盐浓度（饱和度）,酶蛋白溶解度,盐溶效应：,4,详细操作方法：,饱和溶液法:,干粉加入法:,5,影响盐析原因：,温度：,pH：,6,盐析后脱盐处理,透析法：,凝胶过滤法：,新版酶工程酶制剂制备,第4页,CH 4.1,酶制剂工业提取方法,3,酶蛋白初步纯化与浓缩,3.2 有机溶剂沉淀法,除用盐析法沉淀酶蛋白外，还能够用有机溶剂沉淀酶蛋白，当前选取有机溶剂主要有丙酮和乙醇，而且丙酮沉淀效果比乙醇好，但丙酮价格高，蒸馏回收困难，所以当前多采取乙醇作沉淀剂。,沉淀酶蛋白所需乙醇浓度受很多原因影响，溶液离子强度、温度、,pH,值等都影响蛋白质析出，低浓度盐离子有促进蛋白质溶解作用，即所谓盐溶效应；所以当溶液中有低浓度盐离子时，乙醇浓度要增加；温度升高蛋白质溶解度增加，沉淀酶蛋白需要乙醇浓度增加；,pH,值影响因不一样蛋白质而不一样，普通情况下，当溶液,pH,值与酶蛋白等电点一致时，需要乙醇浓度最低，偏离酶蛋白等电点越远，酶蛋白所带电荷越多，蛋白质溶解度越大，沉淀蛋白所需乙醇浓度越高。,普通作为沉淀剂乙醇浓度是,95%,，沉淀不一样酶蛋白需要乙醇量稍有差异。,如沉淀枯草杆菌淀粉酶发酵液时，要求乙醇浓度为：每体积发酵液加,0.2,0.8,体积乙醇；,当沉淀蛋白酶时，加,0.8,1.1,体积乙醇沉淀出主要是中性蛋白酶，加,1.1,1.4,体积乙醇时，沉淀出主要是碱性蛋白酶。,对于每一个酶蛋白沉淀要求乙醇适宜浓度需要试验确定,。,新版酶工程酶制剂制备,第5页,CH 4.1,酶制剂工业提取方法,3,酶蛋白初步纯化与浓缩,3.3,喷雾干燥法,此法是利用喷雾干燥技术，直接将液态酶浓缩成固体酶制剂，此法生产效率较高，工艺过程简单，但此法在生产应用上有一定不足，在喷雾干燥时，需要一定温度，在喷雾塔里面进如一定温度热空气，对于那些对热不稳定酶蛋白不宜使用，现用在生产主要是生产,-,淀粉酶。,3.4 膜分离技术,除上述经典浓缩方法外，当前膜技术发展已应用到酶蛋白浓缩和分离上来了，膜分离技术是以一定孔径高分子膜作为过滤介质，将不一样大小、不一样性状、物质颗粒或大分子进行分离技术。,膜分离技术所使用膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、赛璐玢、尼龙等高分子聚合物制成高分子膜。在膜分离过程中，膜作用是有选择性地小于其孔径颗粒经过，将大颗粒截留，依据欲分离物质颗粒大小，选择不一样孔径膜。,依据物质颗粒经过膜原理及和推进力不一样，膜分离技术可分为以下三种：,加压膜分离,加压膜分离是以膜两侧流体静压差为动力，推进小于膜孔径颗粒经过膜孔，大于孔径颗粒被截留。依据膜孔径大小范围又分为超滤、微滤和反渗透三种。,超滤：,即超出滤，本技术过滤截留颗粒直径在20,A（0.2m),相当于分子量1000510,5,Da,而且有各种规格供选取。此法主要用于酶蛋白浓缩和部分纯化分离，另外，在生化药业也常被采取。,此技术采取滤膜是由丙烯腈、醋酸纤维素、硝酸纤维素、尼龙等高分子聚合物制成高分子膜，膜由两层组成，分表层和基层，表层是滤膜有效层，其厚度为0.15,mm，,孔径大小有各种规格，现有20,A,系列产品销售；基层为支持层，主要负责膜强度，其厚度为200250,m,含有坚韧强度。,影响超滤原因：膜过滤效果用膜流率来表示，即每平方厘米膜每分钟滤过流体量，以,ml./cm2.min,表示，影响流率主要原因有膜孔径大小、颗粒性状、溶液黏度、流体静压。依据上述影响原因，可在一定范围内增加流体静压（普通控制在50700,kPa)、,适当提升溶液温度、增加溶液搅拌述度都可在一定程度上提升膜流率。,超滤技术在当前不论是试验室研究还是酶制剂工业化生产应用都非常广泛，其操作简单，工作效率高，但对于那些有小分子辅酶酶制剂不宜采取此技术。,微滤：,又称微孔过滤，其孔径较超滤膜孔径大，普通在0.22.0,m,范围，主要用于过滤去除细菌及其它显微镜下可见颗粒物质，此法在酶蛋白浓缩和分离方面不用，主要勇于矿泉水、无菌水、软饮料生产方面除菌和除去不溶性颗粒物质。,反渗透：,反渗透膜孔径最小，普通在20,A，,截留分子量为1000,D,主要用于分离各种离子和小分子物质，此技术主要用于生产纯水，海水淡化等。,电场膜分离：将膜分离装置置于电场下，被分离物质在电场作用下，借助电场力作为推进力，以到达分离目标。利用电场膜分离物质，必须具备一个基本条件，那就是其必须是带电粒子，假如其不带电荷，或其静电荷为零，这么粒子就不宜用此法分离。惯用有以下两种方法：,电渗析：,在一个电渗槽内，用两块半通透膜隔成三个室，中间室装待分离液，两侧室装水或缓冲液，并装有电极，接通电源后，带正电荷粒子向负极渗透，而带负电荷粒子向正极渗透，从而到达分离目标。此法多用于酶液脱盐，去除杂质等。,离子交换膜电渗析：,其装置与电荷风析一致，只是所用膜较为特殊，两块膜上带有带电基团，且电性相反，使得带相同电荷粒子不能靠近膜，不致于影响膜通透性。其应用范围与电渗析一致，当溶液浓度较高时，此法工作效率更高。,扩散膜分离：,扩散膜分离主要是指透析方法，将酶溶液装在由扩散膜制成透析袋中，再将透析袋置于扩散介质（缓冲液）中，溶液中小分子就经过膜扩散出来，大分子被截留在袋内。此法主要用于没蛋白脱盐；另外此法还可用于酶蛋白浓缩，当浓缩酶蛋白时，是用高浓度吸水性较强扩散介质，惯用有甘油、聚乙二醇（粉剂）等。,新版酶工程酶制剂制备,第6页,CH4-2,酶蛋白提纯与精制,普通情况下，工业上用大多是经过初步提纯和浓缩即可制备成酶制剂；对于多数医用酶制剂或分析用酶制剂或生化试剂等，则需要进行高度提纯和精制；另外对于开发出新酶制剂，在投入规模化生产前，为研究其各种酶蛋白特征和酶学特征，也需要将酶深入提纯和精制。,酶蛋白提纯经典程序包含：,离子交换层析分子筛过滤层析电泳检测纯度（必要时可进行制备电泳分离）,新版酶工程酶制剂制备,第7页,CH4-2,酶蛋白提纯与精制,1 离子交换层析法,（1）离子交换剂：离子交换剂是借酯化、氧化或醚化等化学反应，在琼脂糖、纤维素或凝胶分子上一些极性基团，经过极性基团静电吸附作用，对极性大分子进行分离。,按离子交换剂上活性基团性质不一样，可分为阳离子交换剂和阴离子交换剂两种。,阴离子交换剂：,当离子交换剂携带阳性基团，用来吸附阴离子时，交换剂称为阴离子交换剂。,当前惯用阴离子交换剂有：,DEAE,纤维素（二乙基氨基乙基纤维素）,DEAE,纤维素适宜用来分离分子量在,10,000-100,000,或以上蛋白质，其稳定性好，装柱后，在洗脱过程中，柱床体积基本保持不变，交换容量大，每克交换剂可吸附,0.1,1.1,毫克酶蛋白。,DEAE,SephadexA50,DEAE,SephadexA50,交换容量更大，（,5.0,毫克,/,克交换剂），但其有一最大不足，就是在洗脱过程中，伴随离子强度增加柱床体积变小，影响分离效果。,AE,纤维素（氨基乙基纤维素）,阳离子交换剂：,阳离子交换剂有：,CM,纤维素（,CMC，,羧甲基纤维素）。,弱酸性阳离子交换剂。,磷酸纤维素（,PC）,中酸性离子交换剂。,新版酶工程酶制剂制备,第8页,CH4-2,酶蛋白提纯与精制,1 离子交换层析法,（2）离子交换分离酶蛋白基本原理：,普通情况下，酶蛋白等电点在,pH7,以下，所以在偏碱性溶液中，酶蛋白带负电荷，所以多用阴离子交换剂；（有些酶蛋白等,电点较高，能够将其置于偏酸性溶液中，这么酶蛋白就带正电荷，分离纯化时应选取阳离子交换剂）。,在同一,pH,条件下，因为不一样蛋白质所带电荷不一样，其与交换剂亲和力不一样，经过梯度增加洗脱剂离子强度，按蛋白质与交换剂亲和力由小到大，依次被洗脱下来，到达分离目标。,新版酶工程酶制剂制备,第9页,CH4-2,酶蛋白提纯与精制,1 离子交换层析法,离子交换拄层析基本程序及关键点：,（以,DEAE,纤维素为例）,离子交换剂处理：首先将,DEAE,纤维素用蒸馏水浸泡溶涨，然后按：,0.5,N,盐酸处理,30,分钟以上（不停搅拌）蒸馏水重复洗涤致中性,0.5,N,氢氧化钠处理,30,分钟（不停搅拌）蒸馏水洗涤致中性。,洗脱液,pH,确实定：采取,pH,梯度测定。,按10交换当量加入离子交换剂和酶蛋白,振荡保温2030,min,静止后，测定上清夜酶活力,到没有酶活力测出试管,pH1，,即为离子交换洗脱液最适,pH,pH1,pH2,pH3,pH6,pH5,pH4,pH7,平衡：装柱后，用洗脱液进行平衡过夜，流述稍大于洗脱流述，使流出缓冲液,pH,与流入相同。,上样和平衡,：,为到达良好分离效果，上样量普通为其交换容量,10,20%,，样品,pH,值和离子强度应与洗脱液一致。,上样后用洗脱,Buffer,平衡。,洗脱曲线：,分部搜集：利用自动分部搜集器搜集。,洗脱：上样后，首先用平衡洗脱液洗脱，主要是洗脱下那些与交换剂结协力很小或不结合杂蛋白；然后，经过改变洗脱液离子强度进行梯度洗脱梯度洗脱公式为：,=,C,2,(C,2,C,1,)(1,v/V),A2/A1,C,2,：,洗脱液极限离子浓度；,C,1,：,初始离子浓度；,v,：,洗脱液流出体积；,V,：,贮液室和混合室总体积；,A,2,：,贮液室截面积；,A,1,：,混合室截面积；,当,A,2,/A,1,等于,1,时，上述公式代表一个直线梯度改变；当小于,1,时，为凹形梯度改变；当大于,1,时，为凸形梯度改变。,装柱：将交换剂搅拌悬浮起来，抽气处理，然后用倾倒法装柱。,(8)搜集与浓缩,新版酶工程酶制剂制备,第10页,CH4-2,酶蛋白提纯与精制,2 分子筛层析法,（1）,分子筛层析法,基本原理,凝胶过滤法是以不一样蛋白质分子量大小差异来将不一样蛋白质分开方法。最惯用凝胶是葡聚糖凝胶（,Sephadex),是由葡聚糖和,3-1,2,环氧化丙烷（交联剂）相互交联而成中央带有微孔球状凝胶颗粒，依据凝胶分子交联程度不一样，共有,SephadexG10,、,G15,、,G25,、,G50,、,G75,、,G100,、,G150,、,G200,等,8,种型号，,G50,以下为硬胶，,G75,以上为软胶。,G10,交联度最高，分子内网孔最小；,G200,交联度最低，分子内网孔最大。,依据蛋白质分子大小不一样，在经过层析柱时，走旅程不一样，从而分开。,（2）凝胶选择：,G25,以下主要用于脱盐和氨基酸，或用于分离分子量在5000以下小肽。,G50,主要用于分离分子量150030000小分子蛋白。,G75 300080000,G100 4000150000,G150 5000300000,G200 5000600000,（,3）凝胶溶胀：,凝胶规格 融胀体积（,ml/g),时间,/h.,20,C,时间,/h.90-100C,G10 23 3 1,G15 2.5-3.5 3 1,G25 4-6 3 1,G50 9-11 3 1,G75 12-15 24 3,G100 15-20 72 3,G150 20-30 72 5,G200 30-40 72 5,(4)装柱：,装柱前必须进行凝胶脱气处理，,装柱要求同离子交换层析,（,5）装柱效果检测：,用带有颜色大分子上样，然后洗脱，检测样品走柱介面效果，惯用蓝色葡聚糖。,（6）,上样：,和离子交换层析有根本不一样。,主要考虑上样体积，普通控制在110。视详细情况而定。,（7）洗脱,洗脱剂能够用低浓度,Buffer，,也可用蒸馏水；,在洗脱过程中，主要控制两个参数：,流速和有效操作压,凝胶规格 流速（,ml/h.cm,2,),有效操作压(,cm/H,2,O),G10,G15,G25,G50,G75 77 160,G100 50 96,G150 23 36,G200 12 16,（8）分部搜集：,基本同离子交换层析,(9)凝胶再生与保留：,再生,：用0.1,mol,盐酸和0.1,mol,氢氧化钠交替浸泡后，蒸馏水洗到中性，重新装柱，可重复使用；,保留：,用0.1,mol,盐酸和0.1,mol,氢氧化钠交替浸泡后，蒸馏水洗到中性；,50乙醇75乙醇95乙醇冰箱保留。,新版酶工程酶制剂制备,第11页,新版酶工程酶制剂制备,第12页,新版酶工程酶制剂制备,第13页,新版酶工程酶制剂制备,第14页,新版酶工程酶制剂制备,第15页,新版酶工程酶制剂制备,第16页,新版酶工程酶制剂制备,第17页,