复方中药粗提物的分级和生物活筛选研究报告.ppt

,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,复方中药粗提物的分级和生物活性筛选,综合化学实验（化学生物学）,授课教师 闫素君 马林,Tel:[phone],cesyansj,一、实验目的,了解复方中药美白原理,掌握中药粗提物的提取方法,传统,/,现代,理解并掌握提取物的分级方法和操作,萃取，减压柱层析,熟悉酶标仪的原理及使用,掌握酪氨酸酶活性测试方法、数据处理方法及表达,二、实验原理,将具有,美白,效果的,复方,中药的粗提物按极性大小,进行分级，建立一个分级库,后，,进行酪氨酸酶活性筛选,（还可以,进行黑色素合成、增殖以及其它靶蛋白的筛选,），从,而系统性地研究中药复方的分子药理学，阐明其作用机制。,1.,提取方法,溶剂法：醇,/,水（,70%,）,2.,分级方法,减压柱层析：避免乳化，提高效率,3.,活性筛选,以邻苯二酚为底物，通过测试反应速率变化（反应体系的,OD,值变化）确定酪氨酸酶活性，从而确定各分级提取物对酪氨酸酶抑制活性的,IC,50,三、实验仪器和试剂,烧杯、砂芯漏斗、抽滤瓶、圆底烧瓶、锥形瓶、塑料样品管、,96,孔酶标板、刮铲、滴管等,旋转蒸发仪、水泵、移液枪、,紫外,-,可见分光光度计,、酶标仪,中药复方,：,甘草,50g,，白芷,20g,，土茯苓,20g,，川芎,20g,，丹皮,10g,，丹参,10g,，当归,10g,，桃仁,10g,，红花,10g,氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇,、二甲亚砜、水,多酚氧化酶粗酶,、,邻苯二酚,、,0.2mol/L,磷酸钾缓冲液,(Ph6.8,）,四、实验步骤,钾缓冲液溶解配成,10ml,左右。在含有,0.93ml pH6.8,的,0.2mol/L,磷酸钾缓冲液,的,离心管中加入,10,l 0.025mol/L,邻苯二酚溶液，,50,l DMSO,，在,30,恒温水浴中预热后或室温直接加入,10,l,酶液，在紫外可见分光光度计,405nm,处测时间扫描值。,OD,值一般在,0.1-0.5/min,之内，如果过大，请减少酶液的用量或者将原酶液稀释后再测定。如果在,0.1/min,范围，可以稀释,5,倍,以备下步实验,。,（,2,）分级样品酶活性测试：,取,96,孔酶标板一块，按表在孔中加入稀释后的酶液,10,l,，样品,10,l,，每孔总体积为,0.2ml,，,DMSO,浓度保持在,5%,，然后加邻苯二酚溶液,10,l,，酶标仪上,405nm,上立即测定，,2,分钟后再测一次，根据两次测定的结果计算酶催化反应速率，再计算抑制率。,将具有较好酶抑制活性的分级产物制作美白面膜并比较使用前后的变化。,3,缓冲液,200,l,缓冲液,缓冲液,缓冲液,无抑制体系,无抑制体系,无抑制体系,无抑制体系,无抑制体系：,10,lDMSO,，,170,l,缓冲液；稀释,5-10,倍的粗酶液（根据前面测试结果稀释）,10,l,，最后统一加,10,l,加邻苯二酚溶液。,其它各排按倍稀释法稀释：,1,行,2,列：,20,l,分级的混合物溶液（,1,）；,160,l,缓冲液 混合后取出,90,l,加入到,2,中，,1,中补加,90,l,缓冲液，稀释,5-10,倍的粗酶液,10,l,，最后统一加,10,l,邻苯二酚溶液；,2,行,2,列：,80,l,缓冲液，,10,lDMSO,，,90,l,来自,1,的溶液，混合后取出,90,l,加入到,3,中，,2,中补加,90,l,缓冲液，稀释,5-10,倍的粗酶液,10,l,，最后统一加,10,l,加邻苯二酚溶液。同法至,8,行,2,列。,1,行,3,列（分级混合物溶液（,2,）,-8,行,3,列，同上。,依次类同，添加完毕后立即进行测试。,五、实验要求,准备好仪器及试剂，规范操作，切勿盲目进行实验。,实验台面保持整齐干净，随时整理，留有最大的工作空间。,公用仪器、药品使用后立即放回原处。,装有易燃性药品的容器不得放在近火旁。,实验完毕后，回收废液，所用仪器洗净放好。检查水、电、仪器开关是否关好。,及时处理实验数据，按照要求撰写实验报告。,结果与讨论,报告的重要部分！,（,1,）数据处理,（,2,）结果分析,实验,愉快,;),