DB21∕T 2589-2016 东部白松种源相关序列多态性（SRAP）分子鉴定实验方法.pdf

ICS 65.020.40 B 64 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 25892016 东部白松种源相关序列多态性（SRAP） 分子鉴定实验方法 Technical regulations of molecular identification method for different provenances of Pinus strobus with SRAP 2016 - 03 - 18 发布 2016 - 05 - 18 实施辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 25892016 I 目 次 前言 . III 1 适用范围 . 1 2 规范性引用文件 . 1 3 术语和定义 . 1 4 原理 . 1 5 仪器和设备 . 1 6 引物 . 2 7 试剂与溶液 . 2 8 实验程序 . 2 9 分析和鉴定 . 5 附录 A（规范性附录）. 6 附录 B（规范性附录）. 7 附录 C（规范性附录）. 9 附录 D（规范性附录）. 10 附录 E（资料性附录）. 11 参考文献 . 12 DB21/T 25892016 II 前 言 本标准依据GB/T 1.1-2009的规则起草。 本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为规范性附录，附录E为资料性附录。 本标准由辽宁省林业厅提出并归口。 本标准起草单位：辽宁省林业科学研究院。 本标准主要起草人：陈 罡，冯 健，王骞春，魏忠平，叶景丰，马冬菁，白丽萍，刘 平，刘怡菲，孟凡金， 田永霞， 张素清， 陈阿梅， 谭桂清， 王 丹， 房春果， 杨长明， 李国军， 丁 彪， 李玉铎， 佟 帅，王显军，侯燕倢，高英旭。 本标准首次发布。 DB21/T 25892016 1 东部白松种源相关序列多态性（SRAP）分子鉴定实验方法 1 适用范围 本标准规定了东部白松种源分子鉴定的实验方法。 本标准适用于利用相关序列多态性（SRAP）法对东部白松种源鉴定的实验过程。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写 3 术语和定义 以下术语和定义适用于本标准。 3.1 相关序列多态性 sequence-related amplified polymorphism; SRAP 利用一对引物对开放阅读框（open reading frames，ORFs）进行扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔序列长度不等而产生多态性。 3.2 聚合酶链式反应 polymerase chain reaction; PCR 在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异扩增待定DNA序列的方法。 3.3 引物扩增多态性 primer amplified polymorphism 一对引物在两个或两个以上不同材料基因组DNA之间扩增，得到数目不同或长度不同的DNA片段。 4 原理 通过一对 SRAP 引物对东部白松基因组 DNA 进行扩增。正向引物（F-primer）含有 17 个碱基，对外显子进行特异扩增；反向引物（R-primer）含有 18 个碱基，对内含子区域、启动子区域进行扩增。因个体不同以及物种的内含子、 启动子与间隔区长度不同而产生多态性。 最终通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳将这些特异的多态性片段分离开来， 通过比较待测种源和对照品种源 DNA 指纹谱带数据的差异， 来判断待测种源与对照种源是否为相同种源。 5 仪器和设备 5.1 PCR 扩增仪。 DB21/T 25892016 2 5.2 琼脂糖凝胶电泳系统。 5.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳系统。 5.4 凝胶成像系统和照相系统。 5.5 超纯水系统。 5.6 低温高速冷冻离心机。 5.7 超微量紫外/可见分光光度计。 5.8 高压灭菌锅。 5.9 液氮罐。 5.10 超低温冰箱。 5.11 高压电泳仪及配套电泳槽。 5.12 移液器（枪）。 6 引物 引物相关信息见附录A。 7 试剂与溶液 7.1 主要常规试剂见附录 B。 7.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂见附录 C。 7.3 银染试剂见附录 D。 8 实验程序 8.1 实验材料 选用东部白松新鲜针叶为材料提取基因组DNA。选取适量样品，装入冻存管，液氮速冻，置于超低温冰箱中， -70 保存备用。 8.2 DNA 的提取 8.2.1 取 0.5 g 洗干净的针叶，用灭菌剪刀剪成小段置 1.5 mL 离心管中(约至 0.1 刻度线)。加适量 PVP（聚乙烯吡咯烷酮）和 VC（抗坏血酸），向离心管中加入液氮后用塑料研磨杵将针叶研磨成粉末。 8.2.2 加入 1 ml 0 预冷的 CTAB-free 提取液，混匀，0 冰浴 10 min，期间轻轻颠倒 2-3 次，在4 下 10000 r/min 离心 10 min，弃上清液。若上清液黏稠，用 CTAB-free 提取液清洗一次。 8.2.3 加入 650 L 65 预热的 4CTAB 提取液，用无菌枪头小心将其混匀，65 水浴 30 min。 8.2.4 加入等体积的氯仿:异戊醇(V:V)=24:1 的抽提液， 轻轻颠倒离心管 10 min， 使其混匀， 10000 r/minDB21/T 25892016 3 离心 10 min，然后用去尖的移液器吸头小心吸取 450 L 上清液至另一离心管中。重复步骤 7.1.4 1-2次，至白色中间层消失为止。 8.2.5 加入 2 倍体积的冰冷（0 以下）无水乙醇，颠倒混匀，出现絮状沉淀，-20 放置 2 h。10000 r/min 离心 10 min，弃上清液。 8.2.6 70%乙醇清洗2遍，风干后加入100 L 灭菌TE缓冲液溶解沉淀。 8.3 DNA 浓度的检测和定量 用 TE 缓冲液配制l g/mL、2.5 g/mL、5 g/mL、7.5 g/mL 和 10 g/mL 的-DNA 分子量标准，各取3 L -DNA分子量标准溶液和3 L 步骤8.2中提取的未知浓度DNA溶液，在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，稳压90 V，电泳缓冲液为1TBE，325 nm紫外灯下观察，照相，通过与标准溶液的荧光进行比较估测未知DNA的浓度。 将步骤7.1中提取的DNA溶液取10 L后，在1.5 mL中用TE稀释200倍，放入石英比色杯中，用紫外分光光度计检测，记下其在260 nm和280 nm的光密度值（OD值），按公式（1）计算出DNA的浓度及OD260和OD280的比值。OD260/OD280应在1.82.0之间。 D= OD260n50/1000 （1） 式中： D DNA的浓度，单位为纳克每微升（g/L）； OD260 260 nm 下的光密度值； n 稀释倍数。 8.4 PCR 反应 8.4.1 PCR 反应体系 在冰盘中或 4 条件下进行操作，在 25 L 反应总体系中，含有 10PCR 缓冲液 2.0 mmol/L， Mg2+ 2.0 mmol/L，dNTPs 0.2 mmol/L，正向、反向引物各 0.3 mol/L，Taq DNA 聚合酶 0.5 U，模板DNA 40 ng/L。 8.4.2 PCR 反应程序 94 预变性 5 min；前 5 个循环为：94 变性 1 min，37 退火 1 min，72 延伸 1 min；后35 个循环为：94 变性 1 min，50 复性 1 min，72 延伸 1 min； 72 延伸 8 min，4 条件下保存。 8.4.3 PCR 产物的处理 PCR 结束后，于 25 L 的反应体系中加入 5 L 的上样缓冲液，颠倒摇晃混匀后，备用。 8.5 聚丙烯酰胺凝胶的制备 8.5.1 玻璃板的清洗 用洗涤剂清洗玻璃板（长板和短板），自来水冲洗干净，随后将玻璃板用蒸馏水冲洗 2 次，再用无屑纸巾沾取无水乙醇擦拭 2 遍，置于通风橱内垂直晾干待用。 DB21/T 25892016 4 8.5.2 胶槽装配 8.5.2.1 玻璃板的固定 将长板玻璃板平铺于通风橱内，边条擦拭后置于玻璃板两侧，随后用短板玻璃板整齐地压盖住，确认边条与两玻璃板均对齐后，将其放入封胶框中并用夹子固定在制胶板上。 8.5.2.2 封胶 配制 1%的琼脂糖凝胶，彻底煮沸后用胶头滴管吸取，沿底边从左至右缓缓灌注入封胶框中，避免出现气泡，待琼脂糖凝胶完全漫过玻璃板底部，停止灌注，待其室温凝固后进行下一步操作。 8.5.3 丙烯酰胺胶的配制 在 50 mL 8% 非变性聚丙烯酰胺储备液中加入 100 L 10%过硫酸铵和 200 L 四甲基乙二胺（TEMED)，迅速轻轻混匀。 8.5.4 灌胶 将固定有封好玻璃板的制胶板向后倾斜放置，配好的 8%非变性聚丙烯酰胺工作液沿玻璃板壁缓慢匀速倒入灌胶口中，避免出现气泡，待胶刚要溢出灌胶口时停止灌胶，将梳子轻轻插入灌胶口中，室温凝固 1 h 以上。 8.5.5 上样和电泳 待凝胶完全凝固后， 将装有凝胶的玻璃板轻轻从制胶板上取下， 灌胶口向内用夹子固定在电泳槽上，使用 1TBE 缓冲溶液灌注电泳仪的上下两槽，使下槽溶液漫过封胶框，上槽溶液漫过灌胶孔。垂直缓慢将梳子从灌胶口中拔出，并用 1TBE 缓冲溶液清洗和整理样品槽。使用 200 L 移液器从左至右逐个对点样孔进行吹打， 直至点样孔内无碎胶、 气泡以及其他杂质。 取 5 L 处理后的 PCR 扩增产物上样，并在胶板的一侧或适当位置的样品槽中加入 4 L 的 DNA Marker（D2000 Marker）作为对照，电泳在200 V 稳压，电流 300 mA 条件下进行，电泳时间约为 2.5 h3 h。 8.5.6 卸胶 电泳结束，关闭电源，将上槽中 1TBE 缓冲液放出，取下固定的夹子，将玻璃板水平放置，起胶铲一侧沿灌胶口边缘缓慢撬起， 将紧贴有凝胶的玻璃板放入装有双蒸水的洗胶盘中， 使凝胶与玻璃板分离，取出玻璃板，放净双蒸水。 8.6 银染 8.6.1 固定 将取出的凝胶小心放入装有 1 L 新配制的 10%冰乙酸（固定/终止液）的塑料方盒中，水平摇床上80 r/min 轻摇 10 min。 8.6.2 漂洗 将胶小心转入双蒸水中漂洗 2 次，每次 2 min，放净双蒸水。 8.6.3 染色 在新配好的 500 mL 硝酸银溶液中加入 1.6 mL 37%甲醛溶液，充分混匀后沿一角倒入装有凝胶的方盒中，水平摇床上 80 r/min 轻摇 10 min 后，放净染色液。 DB21/T 25892016 5 8.6.4 冲洗 在方盒中加入 1 L 双蒸水，脱色摇床上 80r/min 轻摇 30 s，倒净双蒸水。 8.6.5 显影 将 2 mL 37%甲醛溶液加入提前 4 预冷的 500 mL 氢氧化钠溶液中， 充分混匀后沿一角倒入方盒中，水平摇床上 80r/min 轻摇至清楚条带显现。 8.6.6 定影 将胶小心取出，用双蒸水冲洗一次后迅速放入 10%冰乙酸中，水平摇床轻摇 3 min5 min，放净固定液。 8.6.7 漂洗 在双蒸水中漂洗 2 次，每次 2 min。 8.6.8 观测 将凝胶轻轻放在白色透明的日光灯观测箱上， 用玻璃棒铺平凝胶并赶出气泡， 观察和记录电泳结果，用数码相机进行拍照；或用凝胶成像系统扫描拍照。 8.7 谱带记录 选取电泳图上清晰、易于辨认的多态性条带进行记录和统计，根据DNA分子量标准（DNA Marker）计算出每个扩增条带相应的DNA片段分子量大小（近似值），以SRAP引物组合的名称加上DNA片段分子量大小为后缀对条带进行命名， 并分别用“1”和“0”代表“有”带和“无”带的方法仔细记录， 获得DNA指纹图谱数据。也可利用计算机模拟分析图谱。 9 分析和鉴定 将待测种源的电泳结果与原种源的标准谱带相比较，从而鉴定出该种源的真实性。 DB21/T 25892016 6 A A 附 录 A （规范性附录） SRAP（相关序列多态性）标记引物序列 表 A.1 所用 SRAP（相关序列多态性）标记引物序列 引物编号（上游） 序列（53） 引物编号（下游） 序列（53） me1 TGAGTCCAAACCGGATA em1 GACTGCGTACGAATTAAT me2 TGAGTCCAAACCGGAGC em2 GACTGCGTACGAATTTGC me3 TGAGTCCAAACCGGAAT em3 GACTGCGTACGAATTGAC me4 TGAGTCCAAACCGGACC em4 GACTGCGTACGAATTTGA me5 TGAGTCCAAACCGGAAG em5 GACTGCGTACGAATTAAC me6 TGAGTCCAAACCGGTAA em6 GACTGCGTACGAATTGCA me7 TGAGTCCAAACCGGTCC em7 GACTGCGTACGAATTCAA me8 TGAGTCCAAACCGGTGC em8 GACTGCGTACGAATTCTG me9 TGAGTCCAAACCGGTAG em9 GACTGCGTACGAATTCGA me10 TGAGTCCAAACCGGTCT em10 GACTGCGTACGAATTCAG em11 GACTGCGTACGAATTCCA DB21/T 25892016 7 B B 附 录 B （规范性附录） 主要试剂的配制 B.1 0.5 mol/L EDTA-二钠（pH8.0）溶液 将18.61 g 乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA-2H2O）溶于80 mL H2O中，加入氢氧化钠（NaOH）调节pH至8.0，用超纯水定容至100 mL，高压灭菌，4 保存。 B.2 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）溶液 将24.22 g三羟甲基氨基甲烷（Tris）溶解于160 mL水中，用浓盐酸（HCl）调剂pH至8.0，用超纯水定容至200 mL，高压灭菌，4 保存。 B.3 5 mol/L NaCl溶液 将58.44 g氯化钠（NaCl）溶于160 mL水中，定容至200 mL，高压灭菌，4 保存。 B.4 CTAB-free缓冲液 CTAB-free缓冲液的成分为250 mmol/L NaCl、200 mmol/L Tris-HCl（1 mol/L pH8.0）和50 mmol/L EDTA（0.5 mol/L pH8.0）。在600 mL水中加入14.6 g NaCl，搅动溶解后，加入200 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）、100 mL 50 mmol/L EDTA（pH8.0），定容至1000 mL，高压灭菌，4 保存。 B.5 4CTAB提取缓冲液 4CTAB提取缓冲液的成分为4%（质量浓度）溴代十六烷基三甲胺（CTAB）、100 mmol/L Tris-HCl（1 mol/L pH8.0）、20 mmol/L EDTA（0.5 mol/L pH8.0）和1.4 mol/L NaCl（5 mol/L）。在500 mL去离子水中加入40 g CTAB，搅动溶解后。加入100 mL 1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）、40 mL 0.5 mol/L EDTA（pH8.0）和280 mL 5 mol/L NaCl，定容至1000 mL，高压灭菌，4 保存。 B.6 TE（pH8.0）缓冲液 取1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）1 mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）0.2 mL，用水定容至100 mL，高压灭菌，4 保存。 B.7 EB（1 mg/mL）溶液 取 0.05 g 溴化乙锭 （EB） 用 50 mL 水溶解， 用铝箔或黑纸包裹容器， 室温保存， 工作浓度为 1 mg/mL。B.8 10 mol/L NaOH 溶液 称取80 mg氢氧化钠（NaOH），先用160 mL水溶解后，在加水定容至200 mL，高压灭菌，室温保存。 B.9 0.8%琼脂糖凝胶的配制 称取0.8 g电泳级琼脂糖至于200 mL三角瓶中，加入100 mL 1TBE电泳缓冲液，在微波炉中熔化至溶液透明（确保所有琼脂糖颗粒均完全熔化），冷却至50 60 ，加入EB（1 mg/mL）溶液使其终浓度为0.5 g/mL，混匀后倒入放好梳子（距底板约1 mm）的载版上，凝胶厚度为3 mm5 mm，待凝胶完全凝固后放入电泳槽中，然后向槽内加入1TBE稀释缓冲液至液面刚好没过胶版上表面。 DB21/T 25892016 8 B.10 6DNA上样缓冲液电泳(DNA Lording Buffer) 6DNA Lording Buffer，其中含0.05%（质量分数）溴酚蓝、0.05%（质量分数）二甲苯青、30 mmol/LEDTA、36% （质量分数）甘油和ddH2O。使用时按照每5 L DNA样品加入1 L DNA上样缓冲液的比例，混合DNA样品和DNA上样缓冲液，直接加到点样孔即可。 DB21/T 25892016 9 C C 附 录 C （规范性附录） 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂 表 C.1 40%丙烯酰氨（acrilamide）贮备液 成 分 用 量 备 注 丙烯酰氨（acrilamide） 380 g 用 400 mL 去双蒸水加热溶解 甲叉双丙烯酰氨（bis-acrilamide） 20 g 用 200 mL 去双蒸水溶解 最终体积 1000 mL 棕色瓶中室温保存 表 C.2 10%过硫酸铵（ammonium persulphate）溶液 成 分 用 量 备 注 过硫酸铵（ammonium persulphate） 1 g 双蒸水（ddH2O） 10 mL 分装后- 20 保存。 表 C.3 10 倍三羟甲基氨基甲烷-硼酸-乙二胺四乙酸缓冲液（10TBE 缓冲液） 成 分 用 量 备 注 Tris 碱（Tris base） 108 g 硼酸（boric acid） 55 g 0.5 mol/L EDTA（pH8.0） 40 mL 用双蒸水定容至 1000 mL 最终体积 1000 mL 室温保存 表 C.4 8% 非变性聚丙烯酰氨工作液 成 分 用 量 备 注 40%丙烯酰氨贮备液 10 mL 现用现配 10TBE 5 mL 双蒸水（ddH2O） 35 mL 10%过硫酸铵 （ammonium persulphate） 100 L 四甲基乙二酸（TEMED） 200 L DB21/T 25892016 10 附 录 D （规范性附录） 银染试剂 表 D.1 固定/脱色液 成 分 用 量 备 注 冰乙酸（glacial acetic acid） 100 mL 临时配制 双蒸水（ddH2O） 900 mL 表 D.2 硝酸银（AgNO3）染色液 成 分 用 量 备 注 硝酸银（AgNO3） 3 g 37%甲醛（formaldehyde） 1.6 mL 双蒸水（ddH2O） 500 mL 临时配制，避光室温保存 表 D.3 氢氧化钠（NaOH）显影液 成 分 用 量 备 注 氢氧化钠（NaOH） 10 g 用前在 4冰箱预冷 30 min 37%甲醛（formaldehyde） 2 mL 双蒸水（ddH2O） 500 mL 临时配制，避光室温保存 DB21/T 25892016 11 附 录 E （资料性附录） 本实验方法选用辽宁地区引种的 15 个东部白松种源及 SRAP 分析电泳图 表E.1 15个东部白松种源一览表 图E.1 东部白松基因组DNA经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测结果 图 E.2 引物组合 ME6/EM1 在 15 个东部白松种源中的扩增电泳结果 序号 种子区域 种批 纬度 经度 来源/原产地 1 36.675.00 5004 44 30 76 30 抚顺/加拿大 2 27.675.00 4967 46 15 82 45 抚顺/加拿大 3 32.675.00 5003 43 30 81 30 抚顺/加拿大 4 28.675.00 4991 46 15 79 抚顺/加拿大 5 28.675.00 4694 46 15 79 抚顺/加拿大 6 37.675.00 5002 43 81 30 抚顺/加拿大 7 33.675.00 4986 44 80 15 抚顺/加拿大 8 31.675.00 4985 45 15 79 45 抚顺/加拿大 9 34.675.00 4993 44 15 79 45 抚顺/加拿大 10 26.675.00 4700 46 15 84 抚顺/加拿大 11 29.675.00 4963 45 30 78 抚顺/加拿大 12 30.675.00 4965 45 30 77 15 抚顺/加拿大 13 26.675.00 5008 46 30 83 抚顺/加拿大 14 27.675.00 4699 46 83 抚顺/加拿大 15 35.675.00 4992 46 15 79 10 抚顺/加拿大 DB21/T 25892016 12 参考文献 1 顾宇书，邢兆凯，陈罡等. 浑河流域东部白松不同种源 SRAP 指纹构建J. 沈阳农业大学学报，2012，43（5）. 2 王骞春， 冯健， 陆爱君等. 利用 SRAP 标记分析东部白松种源的遗传多样性J. 辽宁林业科技， 2010（6）. 3 王骞春，冯健，陈罡等. 31 个种源东部白松 SRAP 指纹图谱分析J. 辽宁林业科技，2011（6）. 4 王骞春，冯健，陆爱君等. 东部白松 SRAP 反应体系的建立和优化J. 北方园艺，2010（21）.