PCR技术及注意事项.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,PCR,技术应用及注意事项,威斯腾生物技术中心,TEL,：,400 675 6758,2014.9.1,PCR,:,聚合酶链式反应（,P,olymerase,C,hain,R,eaction,）,是一种用于放大扩增特定的,DNA,片段的分子生物学技术。,1971 Khorana,等,最早提出核酸体外扩增的设想；,1983,年,Mullis,发明并申请专利。,背景,根,据,DNA,的半保留复,制。,原理,双链,DNA,单链,复制,两分子拷贝。,在体外实验中，,DNA,在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制,DNA,的变性和复性，加入设计引物，,DNA,聚合酶、,dNTP,就可以完成特定基因的体外复制。,相关,酶,DNA,聚合酶,碱基互补配对,缓冲液,4,种,dNTP,混合物（终浓度）,引物（终浓度）,模板,DNA,Taq,DNA,聚合酶,（耐热,DNA,聚合酶,-,Taq,酶的发现对于,PCR,的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受,90,以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使,PCR,技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。）,Mg2+,（终浓度）,双蒸水,反应体系,变性,-,退火,-,延伸三个基本反应步骤构成。,模板,DNA,的变性：模板,DNA,经加热至,93,左右一定时间后，使模板,DNA,双链或经,PCR,扩增形成的双链,DNA,解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,模板,DNA,与引物的退火（复性）：模板,DNA,经加热变性成单链后，温度降至,55,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列配对结合；,引物的延伸：,DNA,模板,-,引物结合物在,72,、,DNA,聚合酶（如,TaqDNA,聚合酶）的作用下，以,dNTP,为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板,DNA,链互补的半保留复制链,。,重复循环变性,-,退火,-,延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需,2,4,分钟，,2,3,小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,步骤,RT-PCR,：,首先提起,RNA,，然后用逆转录酶与,mRNA,为模板进行,cDNA,第一链的合成，然后的原理和,PCR,就一样了！,RT-PCR,是个半定量,的实验，,可以确定在,mRNA,水平的表达差异。,免疫,PCR(,immuno,polymerase chain reaction,IPCR,）原理：是用一段已知,DNA,分子标记抗体作为探针,用此探针与待测抗原反应,PCR,扩增粘附在抗原抗体复合物上的这段,DNA,分子,电泳定性,根据特异性,PCR,产物的有无,来判断待测抗原是否存在。,巢式,PCR,：,是用内外两对引物扩增拷贝数较低的片,段,。,先,用外引物进行第一轮反应,将产物适当的稀释,然后用内引物继续扩增,.,比较适合微量,DNA,或者石蜡组织抽提的,DNA,。,分类,原位,PCR,技术：原位,PCR,就是在组织细胞里进行,PCR,反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的,PCR,技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术,.,。,实时荧光,PCR,：利用荧光来检测,PCR,产物，,PCR,每循环一次就收集一个数据，通过实时扩增曲线，准确确定,CT,值，从而确,定,DNA,拷贝数。,除此之外，还有锚,定,PCR,、反向,PCR,、不对称,PCR,、长距离,PCR,、降落伞,PCR,、梯度,PCR,等,30,几种,PCR,。,分类,模板：避免污染，提高质量，浓度适宜（,25,-100ng,）。,浓度过高增加非特异,性；,浓度过低会降低扩增效率,，使,PCR,产物量少。,注意事项,引物：设计得当，特异性高。,长度：,15-30bp,碱,基：,G+C,含量以,40-60%,为宜，,G+C,太少扩增效果不佳，,G+C,过多易出现非特异条带。,ATGC,最好随机分布，避免,5,个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。,避,免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是,3,端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。,引,物,3,端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致,PCR,失败。,引,物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。,尤其避免错配！,引,物量：每条引物的浓度,0.1,1umol,或,10,100pmol,，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。,必,要时，引物上可以加入合适的酶切位点，有利于分子克隆。,引物二聚体,dNTP,：,多次冻融会使,dNTP,降解。在,PCR,反应中，,dNTP,应为,50,200umol/L,，浓度过,低会,降低,PCR,产物的产量,。,尤,其是注意,4,种,dNTP,的浓度要相等,(,等摩尔配制,),，如其中任何一种浓度不同于其它几种时,(,偏高或偏低,),，就会引起错配,。,Taq,酶：扩增产物随酶用量的增加，呈增多的趋势。浓度在,10-15U,效果较好。若太高，则降低扩增的特异性；若太低，则会影响,PCR,扩增反应。,Mg2+,：作用是,1.,促进,polymerase,的活性；,2.,核苷酸进入聚合酶的活性中心也需要镁离子来消除,dna,骨架上磷酸基团的负电荷。,浓,度过高可降低,PCR,扩增的特异性，浓度过低则影响,PCR,扩增产量甚至使,PCR,扩增失败而不出扩增条带。,温度：,变性温度：达不到变性温度就不会产生单链,DNA,模板，,PCR,也就不会启动。变性温度低则变性不完全，,DNA,双链会很快复性，因而减少产量。一般取,90,95,。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。,DNA,变性只需要几秒种，时间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持,Taq DNA,聚合酶的活力，加入,Taq DNA,聚合酶后最高变性温度不宜超过,95,。,退火温度：温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，,DNA,扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由,37,反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温度。,延伸温度：引物延伸温度温度的选择取决于,Taq DNA,聚合酶的最适温度。一般取,70,75,，在,72,时酶催化核苷酸的标准速率可达,35,100,个核苷酸,/,秒。每分钟可延伸,1,kb,的长度，其速度取决于缓冲溶液的组成、,pH,值、盐浓度与,DNA,模板的性质。,循环数：循环数过少，,PCR,产物得率低；循环数过多，增加非特异性。循环次数常规,PCR,一般为,25,40,个周期。在保证产物得率前提下，应尽量减少循环次数。,Real-time Quantitative PCR Detecting System,QPCR,实,时检测（在对数扩增时期）而不是终点检,测,敏,感性,高,需,要样品,少,特,异性高（,Taqman,）,精,确定量,Real-timeqPCR,和常规,PCR,的区别,基线（,Base Line,）：指在,PCR,扩增反应的最初几个循环里，荧光信号变化不大，接近于一条直线。这样的直线，即是基线。,荧光域值（,threshold,）：一般是指,PCR,反应的前,15,个循环的荧光信号，这是作为荧光本底信号。荧光域值的缺省设置是,3-15,个循环的荧光信号的标准偏差的,10,倍。设定在,PCR,扩增的指数期。,Ct,值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数,。,Ct,值与起始模板的关系：研究表明，每个模板的,Ct,值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，,Ct,值越小。,扩,增曲,线：在,PCR,过程中，以循环数为横坐标，实时荧光信号强度为纵坐标所做的曲线。,该,技术以美国,ABI,公司为代表。,PCR,扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针。该探针为一直线型的寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，,PCR,仪检测不到荧光信号；,PCR,扩增时（在延伸阶段），,Taq,酶的,5,3,外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条,DNA,链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与,PCR,产物形成完全同步，这也是定量的基础所在。,Taqman,技术,：,TaqMan,引,物、探针设计：,首先选择探针序列,探,针的,Tm,值为,68,70,度，长度不应超过,30,碱基,探针的,5,端不应是,G,，,G,有可能会淬灭荧光素,引物应尽量靠近探针，扩增片断不超过,400bp,，通常为,80,150bp,引物的,Tm,值为,59,60,度，长度约,20,碱基,避免引物、探针之间的二级结构,该,技术以美国人,Tagyi,为代表。也是加入了荧光探针，但它是环状的寡核苷酸探针，分别由茎部和环部组成，两端分别标记 荧光报告基团和荧光猝灭基团，在无靶序列的情况下，探针始终是环状，报告基团的荧光被猝灭基团猝灭，使荧光检测仪检测不到荧光信号；而在有靶序列时，即在,PCR,的退火阶段探针与靶序列结合，使荧光报告基团和猝灭基团分开，这样荧光仪可以检测到荧光，荧光信号的强弱代表了靶序列的多少。,Beacon,技术,：,上两种方法特异性强，但是成本较高，探针设计要求较高。,SYBRGreen,是,一种结合于小沟中的双链,DNA,结合染料，与双链,DNA,结合后，其荧光大大增强。,SYBRGreen,从实验成本来讲，,Sybr,Green,是最好的，基本上就是普通,PCR,加,上,Sybr,Green,I,荧,光染料即可，其信号强度也很好，还可以进行融解曲线分析等，但缺点是只能在一个反应管内进行一种,PCR,反应的检测，另一个问题是非特异性扩增会影响实验 结果，当然也有一些技术解决这些问题。对于研究人员来讲，如果需要检测的基因很多，而每个反应管中进行一种,PCR,反应的检测可以满足实验要 求，则,Sybr,Green,是最好的选择。,溶解曲线分析可以用来确定不同的反应产物，包括非特异性产物。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生溶解曲线，随着反应中双链,DNA,变性,，荧光染料又,回复到游离状态导致荧光信号降低，用荧光信号改变的负的一次导数与温度作图，在扩增产物的溶解温度上有一特征峰（,Tm,，,DNA,双链解链,50,的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引,物二聚体区,分开，因为它们在不同的温度溶解,.,这个一般是用,SYBY Green,作,为荧光染料的,时候需要做的工作！,溶解曲线,1.,无,Ct,值出现,检,测荧光信号的步骤有误,:,一般,SG,法采用,72,延伸时采集，,Taqman,法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。,引,物或探针降解,:,可通过,PAGE,电泳检测其完整性。,模,板量不足,:,对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。,模,板降解,:,避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况,。,QPCR,常见问题分析,2,.,Ct,值出现过晚（,Ct38）,扩增效率低,:,反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。,PCR,各种反应成分的降解或加样量的不足。,PCR,产物太长,:,一般采用,80-150,bp,的产物长度。,QPCR,常见问题分析,3,.,标准曲线线性关系不佳,加,样存在误差,:,使得标准品不呈梯度。,标,准品出现降解,:,应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。,引,物或探针不佳,:,重新设计更好的引物和探针。,模,板中存在抑制物，或模板浓度过,高。,QPCR,常见问题分析,4,.,负对照有信号,引,物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。,引,物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。,镁,离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的,mix,试剂盒。,模,板有基因组的污染：,RNA,提取过程中避免基因组,DNA,的引入，或通过引物设计避免非特异扩增,。,QPCR,常见问题分析,5.,溶解曲线不止一个主峰,引,物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。,引,物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。,镁,离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的,mix,试剂盒。,模,板有基因组的污染：,RNA,提取过程中避免基因组,DNA,的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。,QPCR,常见问题分析,6,.,扩增效率低,反,应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。,反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。,反应体系中有,PCR,反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。,QPCR,常见问题分析,7.,扩增曲线的异,常,。,比,如“,S”,型曲,线。,参,比染料设定不正确,(,MasterMix,不加参比染料时，选,NONE),模,板的浓度太高或者降解,荧,光染料的降解,QPCR,常见问题分析,Thank 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