实验3质粒DNA的提取与鉴定.ppt

,,,酶切与鉴定,,Center of Biochemistry and Molecular Biology,尹莉,E-mail:qsdyl_2006,实验内容,提取原理,操作步骤,计算方法,操作步骤,质粒,DNA,定量,酶切原理,酶切步骤,酶切,电泳原理,电泳步骤,电泳,实验目的,掌握,碱裂解法,提取质粒的方法,了解,紫外吸收法,检测,DNA,浓度与纯度的原理、方法,学习水平式,琼脂糖凝胶电泳,操作,第一部分 质粒,DNA,提取与定量,Extraction and,Quantitation,of Plasmid DNA,独立于细菌染色体外，能独立自主复制的闭合环状,DNA,分子；,存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多,质粒（,lasmid,）,定 义,碱裂解法,煮沸裂解,羟基磷灰石柱层析法,质粒,DNA,释放法,酸酚法等,方 法,选择哪一种方法主要取决以下几个因素：,质粒的大小,大肠杆菌菌株,裂解后用于纯化的技术和实验要求,分离质粒,DNA,的方法都包括,3,个基本步骤：,培养细菌使质粒扩增；,收集和裂解细菌；,分离质粒,DNA,分离质粒,DNA,三步曲,分离,质粒,收集,裂解,细菌,质粒,扩增,基本步骤,基本原理,1,、碱裂解法,基于染色体,DNA,与质粒,DNA,的变性与复性的差异；,高碱性条件下，染色体,DNA,和质粒,DNA,变性；,当以高盐缓冲液调节其,pH,值至中性时，变性的质粒,DNA,复性并保存在溶液中，染色体,DNA,不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心形成沉定去除；,原理示意图,2,、离心层析柱,基本原理,硅基质膜,在高盐、低,pH,值状态下选择性地结合溶液中的质粒,DNA,，不吸附蛋白质、多糖等物质；,通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；,低盐，高,pH,值的洗脱缓冲液将纯净质粒,DNA,从硅基质膜上洗脱；,（一）仪器：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式离心机、高压灭菌锅,（二）材料：含,pMD18-T,质粒的大肠杆菌,DH5,（三）试剂：,LB,培养基（液体、固体）,Bioteke,质粒提取试剂盒（北京百泰克，中国）,溶液,P1,溶液,P2,溶液,P3,去蛋白液,PE,漂洗液,WB,洗脱液,EB,仪器材料,50mmol/L,葡萄糖,25mmol/L Tris,Cl(pH8.0),10,mmol,/L EDTA(pH8.0),作用：分散细胞，鳌合金属离子使金属酶失活,注意：菌液一定悬浮均匀，不能有结块,溶液,I,0.2 mol/L,NaOH,1%SDS,作用：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。,注意：时间勿太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次,溶液,II,5mol/L,乙酸钠,60ml,冰乙酸,11.5ml,水,28.5ml,作用：酸性条件下质粒,DNA,复性，变性蛋白,-SDS,线性,DNA,沉淀，,Na,可中和,DNA,注意：复性时间不宜过长,溶液,III,菌液,离心,12000rpm,1min,弃上清,短时离心,彻底弃上清,加,250l,溶液,P1,旋涡振荡,悬浮沉淀,加,250l,溶液,P2,加,400l,溶液,P3,颠倒,颠倒数次,放置,3-5min,离心,13000rpm,10min,取上清,700l,加到吸附柱中,离心,13000rpm,1min,弃滤液，加入,500l,去蛋白液,13000rpm,1min,离心,（,1,）,（,2,）,（,3,）,（,4,）,（,5,）,（,6,）,（,7,）,（,8,）,（,9,）,弃滤液，加入,500l,漂洗液,WB,（,10,）,离心,13000rpm,1min,弃滤液，加入,500l,漂洗液,WB,（,11,）,离心,13000rpm,1min,弃滤液,（,12,）,离心,13000rpm,2min,放入一个,干净的离心管,中，在,吸附膜的中间,加,70l,洗脱液,EB,离心,13000rpm,1min,（,13,）,-20,保存备用,操作步骤,第二部分 酶切鉴定,DNA Restriction Enzyme Digestion,试剂名称,体积,(,l),无菌水,9.0,10M,酶切缓冲液,2.0,质粒,DNA,7.0(,约,500ng),Hind,III(15U/ul),1.0,EcoR,I (12U/ul),1.0,总体积,20.0,在一个洁净的,1.5mlEP,管中按顺序依次加入下述试剂,移液枪轻轻混匀,(,避免产生气泡,),37,水浴,1.5h,反应体系,限制性内切酶,（,restriction,endonuclease,）,是,DNA,操作过程中所使用的基本工具。,特异性地结合于一段被称为限制酶识别序列的特殊,DNA,序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链,DNA,。,分子克隆中常用的为,II,类限制酶，,其识别位点长度为,4,、,5,或,6,个核苷酸的反向重复序列。,限制性内切酶,限制酶的切割点因酶而异，,有的在,对称轴处切,割,产生,平末端,的,DNA,片段,如,HaeIII,有的切割位点在,对称轴一侧,，,产生带有单链突出末端的,DNA,片段称,粘性末端,，,如,EcoR,.,限制性内切酶,平末端,在识别顺序的中心对称轴处切割,5,G-G-C-C 3,3,C-C-G-G 5,5,G-G,3,C-C,-C-C 3,-G-G 5,HaeIII,限制性内切酶,3,端粘性末端,在识别顺序的双侧末端切割,DNA,双链，于对称轴的3,末端切割。,5,G-G-T-A-C-C 3,3,C-C-A-T-G-G 5,G-G-T-A-C 3,C,C,3,C-A-T-G-G,Kpn,I,限制性内切酶,5,G-A-A-T-T-C 3,3,C-T-T-A-A-G 5,G,C-T-T-A-A 5,5,A-A-T-T-C,G,EcoRI,5,端粘性末端,在识别顺序的双侧末端切割,DNA,双链，于对称轴的5,末端切割。,5,A-A-G-C-T-T 3,3,T-T-C-G-A-A 5,A,T-T-C-G-A 5,5,A-G-C-T-T,A,HindIII,限制性内切酶,双酶切限制酶的选择非常重要，,尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶，提前看好各公司的双切酶所用公用的,BUFFER,如果有一种,buffer,能同时使,2,种酶的活力都超过,70%,的话，就可以用这种,buffer,作为反应,buffer,；,如果两种酶厂家不同无法查时可比较其,buffer,成份，相似的话可以考虑各取一半中和。,限制性内切酶,Buffer,的选择查阅内切酶供应商在目录后的附录中提供的各种酶在不同,buffer,中的活力表,酶量的选择任何时候,2,种酶的总量不能超过反应体系的,1/10,体积，而且最大反应体系最好不要小于,20,ul,。,以,TAKARA,的为例，其对,1,单位酶的定义如下：在,50,l,反应液中，,30,温度下反应,1,小时，将,1,g,的,DNA,完全分解的酶量定义为,1,个活性单位,(U),。而该酶浓度约为,15,单位,/,微升，在除外酶降解的 因素外该酶可分解,15g,的,DNA,。,限制性内切酶,插入,400bp,DNA,片段,质粒大小为,:,2692bp+400bp=3092bp,酶切片段大小为,?,影响酶切反应的因素,底物,DNA,的纯度：,主要污染,DNA,的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反应,;,反应系统：,主要是反应缓冲液中的离子强度,如,NaCl,和,Mg,2+,合适离子强度可以激发酶切反应,;,反应体积：,一般应尽量小，且酶切反应中甘油浓度应低于,5%;,保温时间与温度：,温度改变会使酶识别错误,;,限制性内切酶,紫外光吸收法,原理：,1,物质在光的照射下会产生对光的吸收效应,2,而且物质对光的吸收是具有选择性的,3,各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱,因此不同波长的单色光通过溶液时其光的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系,.,定量检测,计算方法,:,因为组成核酸的碱基,(G,A,T,C,）在,260nm,处具有强吸收峰，所以通过测定,260nm,的吸收峰即可对,DNA,进行定量。,dsDNA,(,双链,DNA),1OD,260,=50ug/ml,ssDNA,(,单链,DNA),1OD,260,=33ug/ml,RNA,1OD,260,=40ug/ml,定量检测,记录,OD,260,值，通过计算确定,DNA,浓度，公式如下,:,质粒,DNA(,g,/ml)=50,(OD,260,),稀释倍数,注意,:,我们接下来要用的,eppendorf,公司生产的紫外分光光度计,会根据样品的稀释倍数自动算出质粒,DNA,的最终浓度和,Ratio,值,.,定量检测,根据在,260nm,以及在,280nm,的读数比值估计核酸的纯度,（,Ratio=A,260,/A,280,）,Ratio=1.8,DNA,样品较纯,符合实验要求,Ratio,1.9,RNA,污染,Ratio,1.6,有蛋白质或其它杂质的污染,定量检测,实验仪器,定量检测,紫外分光光度计,比色杯,数据处理,测量次数,质粒,DNA,浓度,(,g/ml),Ratio,值,(A,260,/A,280,),1,2,3,平均值,定量检测,菌体老化,碱裂解不充分,菌体中无质粒,溶液使用不当,请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养,可减少菌体用量或增加溶液的用量,不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。检查抗生素使用浓度是否正确。,溶液,在温度较低时可能出现浑浊，置于,37,保温片刻直至溶解为清亮的溶液。,问题一：未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？,原 因,对,策,常见问题,混有蛋白,混有,RNA,混有基因组,DNA,不要使用过多菌体。重新纯化,DNA,，去除蛋白、多糖、多酚等杂质,加入,RNaseA,室温放置一段时间,加入溶液,II,和,III,后,防止剧烈振荡，可能把基因组,DNA,剪切成碎片从而混杂在质粒中,。细菌培养时间过长会导致细胞和,DNA,的降解，培养时间不要超过,16,小时。,问题二：质粒纯度不高，如何解决？,原因,对,策,常见问题,定量检测,第三部分 琼脂糖凝胶电泳,DNA,A,garose,G,el,E,lectrophoresis,天然琼脂（,Agar）,是一种多聚糖，主要由琼脂糖（,Agarose,，,约占80）及琼脂胶（,Agaropectin,）,组成。,琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。,琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。,定 义,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度,DNA,分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动,.,DNA,分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同的,DNA,，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带,(,迁移速度与分子量的对数值成反比关系,).,实验原理,1,、,DNA,的分子大小,2,、琼脂糖浓度,3,、,DNA,分子的构象,4,、电源电压,5,、嵌入染料的存在,6,、离子强度影响,影响迁移速率因素,分离范围,.,电泳指示剂：,核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。,Gelview,TBE,琼脂糖,5,、,DNA Marker 5000,实验材料,溴化乙锭,(EB),:3,8-,二氨基,-5-,乙基,-6,苯基菲啶溴盐,),，可与,DNA,结合,在紫外光照射下,呈现红橙荧光,有致癌性,.,Gelview,:,是一种新型核酸染料,可与,DNA,分子形成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比,EB,高,且荧光强度与,DNA,含量成正比荧光,在紫外光照射下,呈现绿色荧光,.,常用染料,实验材料,是分子量不同的,DNA,片段，主要用途就是,DNA,分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测琼脂糖凝胶是否有问题。,DNA Marker,应选择在目标片段大小附 近,ladder,较密的,marker,，这样对目标片段大小的估计较准确。,实验材料,电泳缓冲液,4,保存备用,实验材料,凝胶准备,胶床准备,铺胶,静置,胶床置于电泳槽中,加电泳缓冲液,拔梳子,上样,电泳,取出凝胶,拍照,实验步骤,加样量,质粒,DNA,：,10,*,loading buffer+4l,酶切产物：,10,*,loading buffer+2l,用移液枪吹打混匀（避免产生气泡）后各取,10l,点样,点样要集中、迅速，否则样品会挥发，影响成像,每组点两种样品：质粒,DNA,和酶切产物两条带,每组记清自己点样的位置,倒胶时把握好胶的温度，,不要高于,60,，否则温度太高会使制板变形,胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔,电泳前，确认样品孔位于电场负极；,点样时枪头下伸，,点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多,Geldview,有毒，,切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔,紫外线照射不要太久,注意事项,M 1 2 3 4 5 6 7,8 9 10 11 12,5000,bp,3000,bp,2000,bp,1500,bp,1000,bp,750,bp,500,bp,250,bp,100,bp,M:DL5000 DNA Marker,1,4,7,10,为,PCR,目的条带,;,2,5,8,11,为质粒,3,6,9,12,为酶切片段,酶切长片段,含目的,DNA,片段的酶切短片段,实验结果,思考题,碱法提质粒中溶液,I,、,II,、,III,的作用？,结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？,影响,PCR,的主要因素有那些,?,