大肠细菌的基因芯片鉴定.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验三基因芯片鉴定大肠细菌,基因芯片,：,是指将特定的,DNA,或寡聚,核苷酸,片段通过,物理化学,方法固定于玻璃、尼龙甚至塑料片上,使多基因分析可同时进行的一种装置。,基因芯片上可固定不同物种特定基因的探针，将从样品中提取并经,PCR,扩增和荧光标记的特异基因片段与基因芯片上的探针杂交，利用专门的光学仪器，能够检测到这些杂交信号（带有荧光标记的双链核酸），杂交信号出现在某物种的探针位点上，说明样品来自于该物种。,基因芯片上固定探针的方法,通过化学修饰可以使玻片成为表面富含氨基的基片。在中性溶液中，基片上的氨基所带的正电荷与核酸分子上的磷酸所带的负电荷相互作用，使核酸吸附在基片表面。加热和紫外照射可以增强固定效果，但紫外交联容易导致,DNA,断裂或,DNA,分子间形成干扰杂交的网状结构，所以一般还是采用加热固定。,本实验使用的基因芯片上固定有大肠杆菌,HSP70,基因和黄单胞菌,HTPG,基因的特异探针，可用于鉴定这两种细菌。,基因芯片制作和检测的原理,实验方案,本实验共分为四个部分：,一、大肠杆菌培养,二、提取大肠杆菌基因组,DNA,三、,PCR,扩增其,HSP70,基因，电泳检测扩增产物,四、扩增产物与基因芯片杂交并检测杂交信号,第一部分 细菌培养,配制,100ml LB,液体培养基，蛋白胨,1g,，酵母提取物,0.5g,，氯化钠,1g,，加重蒸水,100ml,，用,NaOH,调,pH,至,7.0,，高压灭菌。,将大肠杆菌单菌落接种于,LB,培养基中，,37,恒温摇床上培养过夜，摇床转速约为,280r/min,。,第二部分,提取纯化大肠杆菌基因组,DNA,第二部分 实验步骤,1,、,取培养的菌液,10ml,，,4000r/min,离心,10min,，除去上清液。,2,、加入,1ml TE,，使细菌沉淀充分悬浮。,3,、加入,0.2ml 10%SDS,溶液，再加入,10l 20 mg/ml,蛋白酶,K,，,37,水浴中温育,1h,。,(,SDS,溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，,SDS,还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶,K,能水解消化蛋白质，特别是与,DNA,结合的组蛋白。,),4,、取出离心管，加入,0.2ml 5mol/L NaCl,溶液，混匀后再加入,0.2ml CTAB/NaCl,溶液，,65,水浴中温育,20min,。,5,、加入与菌液等体积（,1.6ml,）的苯酚,/,氯仿,/,异戊醇混合液，用漩涡混合器混匀，,4000r/min,离心,10min,。注意吸取混合液前将混合液充分振荡混匀。,6,、取上层水相至无菌离心管，再加入等体积的氯仿,/,异戊醇混合液，用移液器反复吹打混匀，,4000r/min,离心,10min,。,7,、将上层水相转移到另一个无菌离心管中，加入,2l RNase A,，,37,水浴中温育,30min,。,8,、加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，充分振荡，,抽提残留在水相中的苯酚。,4000r/min,离心,10min,。,9,、将上清液移至新的离心管中。,10,、加入上清液,1/10,体积的,3mol/L NaAc,溶液，以及上清液,2,倍体积的无水乙醇，颠倒混匀以沉淀,DNA,。室温下静置,10min,，,DNA,形成白色（或淡黄色）絮状沉淀。,11,、用移液器轻轻吸住白色絮状沉淀，将其转移到装,有适量,75%,乙醇的,1.5ml,离心管中。上下颠倒漂洗，洗去杂质。,7500r/min,离心,5min,。,12,、去上清液，沉淀干燥后溶解于,100l TE,中。,取,10,l,提取的基因组,DNA,溶液加,1.99ml,水稀释后测量,OD,260,，蒸馏水作为空白，计算,DNA,产量（,1 OD260,50,g DNA/ml,）。,-,20,贮存其余基因组,DNA,，待下一实验用作,PCR,反应的模板。,DNA,产量测定,试 剂,1,、,TE,：,10mmol/L TrisHCl,，,1mmol/L EDTA,2,、,CTAB,（,十六烷基三甲基溴化铵,）,/NaCl,：,将,4.1g NaCl,溶解 于,80ml,水中，缓慢加入,10g CTAB,，定容至,100ml,。,3,、,苯酚,/,氯仿,/,异戊醇混合液：,水饱和酚,:,氯仿,:,异戊醇,=25:24:1,（体积比）。,4,、,氯仿,/,异戊醇混合液：,氯仿,:,异戊醇,=24:1,（体积比）。,5,、,10g/l RNase A 10%SDS,20 mg/ml,蛋白酶,K 5mol/L NaCl,3mol/L NaAc,无水乙醇,75%,乙醇,。,第三部分,PCR,扩增,组,分,剂,量（,l,）,基因组,DNA,模板,10-100ng,10Taq Buffer,3,4dNTP,（各,10mol/L,）,0.5,上游引物（,HEX,标记）,1,下游引物（,HEX,标记）,1,Taq DNA,聚合酶,(2.5U/,l),0.5,dH,2,O,（随模板体积变化）,总体积,30,PCR,反应程序,阶段,温度,时间,起始变性,94,3min,变性,94,30s,循环,30,次,退火,60,30s,延伸,72,45s,最后延伸,72,10min,第四部分基因芯片杂交和检测,每个阵列的探针排布,标记有,HEX,的核酸,（无标记的大肠杆菌,HSP70,基因扩增产物）,（无标记的黄单胞菌,HtpG,基因扩增产物）,50%DMSO,器材,耗材,软件,实验步骤,（,1,）准备芯片：去掉杂交围栏上的胶纸，将杂交围栏放在杂交模具中心的同样形状的凹槽中，胶面朝上，注意要使杂交围栏与凹槽契合。用手捏着芯片上贴有标签纸的一端，将芯片另一端顶着模具的顶端，然后将芯片正面（贴有标签纸）朝下放入模具。在芯片背面相应位置用镊子轻轻向下按，使杂交围栏紧贴在芯片上。,撕去围栏上的保护纸,贴 围 栏,第四部分 实验步骤,（,2,）往杂交盒底部凹槽中均匀加入少量蒸馏水（约,200,l,），以防止杂交过程中杂交液大量挥发。把芯片有杂交围栏的一面朝上放入杂交盒中，按芯片摆放方向盖上盖片，注意使盖片上的凸面朝下。,盖片,芯片,标签端,盖片正面观,往杂交盒底部的凹槽中加水,将贴好围栏的芯片放入杂交盒,注意：围栏朝上,盖上盖片,注意：盖片的凸起面向下,第四部分 实验步骤,（,3,）杂交：将杂交液用移液器混匀后,3000r/min,离心,30s,，,95,热变性,3min,。冰浴骤冷,1min,。用移液器将杂交液注入盖片上的小孔。盖上,杂交盒的盖板，两侧用两个卡子扣上，确保杂交盒的密封性。,在,42,水浴中杂交,2,小时。,加杂交液,盖上盒盖，插上卡子,放入恒温水浴中保温,第四部分 实验步骤,（,4,）清洗：,洗液先预热至,42,。,将芯片转移到盛放洗液的清洗盒中，杂交面朝上，放在水平摇床上清洗。依次在洗液,、,中各清洗,4,分钟。然后放在,50ml,锥形离心管中（标签纸端朝下），,1500 r/min,离心,1,分钟以除去芯片表面的水分。,（,5,）,扫描及结果测定：启动微阵列芯片扫描仪系统，进行芯片扫描，保存检测结果。,清洗,甩干,基因芯片扫描仪,微阵列芯片扫描仪,EcoScan,100,基因芯片扫描仪工作原理,基因芯片扫描仪工作流程,软件界面,按钮区,状态栏,图象显示区,控制区,大肠杆菌的检测结果,黄单胞菌的检测结果,试 剂,（,1,）,20,SSC,：,在,800ml,水中溶解,175.3g NaCl,和,88.2g,柠檬酸钠，加入数滴,HCl,溶液调,pH,至,7.0,，加水定容至,1000ml,，分装后高压灭菌。,（,2,）杂交液：,6l 100,甲酰胺，,0.24l 10,SDS,，,1.8l 20,SSC,和,4l,荧光标记的,PCR,扩增产物。,（,3,）洗液,：,2,SSC,，,0.2%SDS,（,4,）洗液,：,0.2,SSC,