植物组织培养的基本方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,植物组织培养的基本方法,目的要求,1,一般掌握灭菌和消毒的区别,2,掌握灭菌的方法和具体操作过程,3,掌握无菌接种的步骤,4,掌握外植体的选择、培养方法和步骤,5,一般掌握外植体褐变和玻璃化的处理方法,6,掌握试管苗驯化的基本程序,7,一般掌握快速繁殖试管苗的计划安排及增殖倍数计算方法,灭菌,灭菌是组织培养重要的工作之一。初学者首先要清楚有菌和无菌的范畴。,这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。,灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把,所有生命的物质全部杀死。,消毒，它指杀死、消除或充分抑制,部分微生物,，使之不再发生危害作用，显然经过消毒，许多细菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不会完全杀死，即消毒后的环境里、物品上还有活着的微生物。,而通过严格灭菌的操作空间（接种室、超净台、等）和使用的器皿，以及操作者的衣着和手都不带任何活着的微生物。在这样的条件下进行操作，就叫做,无菌操作。,常用的灭菌方法可分为,物理的和化学的,两类。,物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施。,化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。,这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用。,1,培养基用湿热灭菌,培养基在制备后的,24,小时内,完成灭菌工序,按容器大小不同，保压时间有所不同（下表）。,容器的体积（,ml,）,在,121,灭菌所需最少时间（,min,）,2.,用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌,在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入,95%,的酒精,中，使用之前取出在酒精灯火焰上,灼烧灭菌,。冷却后，立即使用。操作中可采用,250,或,500ml,的广口瓶，放入,95%,的酒精，以便插入工具。,3.,玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌,干热灭菌是利用烘箱加热到,160,180,的温度来杀死微生物。,通常采用,170,持续,90,分钟,来灭菌,。,4.,不耐热的物质采用过滤灭菌,一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用,过滤灭菌方法,-,防细菌滤膜。,5.,空间采用紫外线和熏蒸灭菌,（,1,）紫外线灭菌,在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用,辐射因子,灭菌。,细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。,紫外线的波长为,200,300nm,，其中以,260nm,的杀菌能力最强，但是紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和,物体表面,的灭菌，且要求距照射物以不超过,1.2,米为宜。,（,2,）熏蒸灭菌,用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。升汞与高锰酸钾，常用熏蒸剂是,甲醛,。,6.,一些物体表面用药剂喷雾灭菌,物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手表面、植物材料表面等。可用,70,的酒精,反复涂擦灭菌，的来苏儿溶液以及,0.25,的新洁尔灭也可以。,7.,植物材料表面用消毒剂灭菌,外植体的选择,:,外植体部位：不同植物以及同一植物的不同器官对诱导条件的反应不一样；,取材季节：大多数植物应该在生长开始的时候采集；,器官的生理状态和发育年龄：幼年组织比老年组织具有较高的形态发生能力；,外植体大小：茎尖培养中，外植体越小成活率越低。,外植体的灭菌方法,:,植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做,接种,。接种的植物材料叫做外植体。,首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗，硬的材料用刮刀刮。,第二步是对材料的表面浸润灭菌。,第三步是用灭菌剂处理。,最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次,3,分钟左右，视采用的消毒液种类，涮洗,3,10,次左右。,常用的消毒剂：既要考虑具有良好的消毒、杀菌作用，同时又易被蒸馏水冲洗掉或分解掉；应当正确选择消毒液的浓度和处理时间，应尽量减少组织的死亡；一些表面消毒剂的消毒效果不相同。,灭菌剂,使用浓度,持续时间,(min),去除的难易,效果,次氯酸钙,90-100g/l,5,30,易,很好,次氯酸钠,5-20g/l,5,30,易,很好,漂白粉,饱和溶液,5,30,易,很好,氯化汞,0.1-10g/l,2-10,较难,最好,乙醇,700-750ml/l,0.2-2,易,好,过氧化氢,100-120ml/l,5-15,最易,好,溴水,10-20ml/l,2-10,易,很好,抗菌素,4,50mg/L,30,60,中,较好,接 种,接种是将已消毒好的根、茎、叶等离体器官，经切割或剪裁成小段或小块，放入培养基的过程。,接种前后的程序：,A,：接种室消毒：用酒精擦拭台面，接种工具摆放好后用紫外灯照射表面灭菌,15-20,分钟，然后通风,20,分,钟；,B,：手要洗净，用,75%,酒精擦手，在操作过程中要经常用酒精擦手；,C,：将初步洗涤及切割的材料放入烧杯（烧杯用,75%,酒精擦杯壁），带入超净台上，用消毒剂灭菌，再用无菌水冲洗最后沥去水分，取出放置在灭过菌的层纱布上或滤纸上。,D,：材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。,E,：用灼烧消毒过的器械将切割好的外植体插植或放置到培养基上。,培养,培养：指把培养材料放在培养室（有光照、温度条件）里，使之生长，分裂、分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。,（一）培养方法,1,固体培养法,即用,琼脂,固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。该法设备简单，易行。但养分分布不均，生长速度不均衡。并常有褐化中毒现象发生。,2,液体培养法,即用,不加固化剂,的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用,往复式摇床或旋转式摇床,进行培养，其速度一般为,50,100,转分，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。,静止培养：滤纸桥培养,振荡培养：磁力搅拌器、摇床、自旋式培养架,(,二）培养步骤：,1,初代培养：即接种某种外植体后，最初的几代培养。,初代培养旨在获得无菌材料和无性繁殖系。,初代培养时，常用,诱导或分化培养基,，即培养基中含有较多的细胞分裂素和少量的生长素。初代培养建立的无性繁殖系包括茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。,（,1,）顶芽和腋芽的发育,采用外源的细胞分裂素，可促使具有顶芽或没有腋芽的休眠侧芽启动生长。适宜这种再生繁殖的植物，在采样时，只能采用顶芽、侧芽或带有芽的,茎切段,，其它如种子萌发后取,枝条,也可以。,（,2,）不定芽的发育,在培养中由外植体产生不定芽,通常首先,要经脱分化过程,形成愈伤组织的细胞。,多数情况下它先形成芽，后形成根。,另一种方式是从器官中直接产生不定芽，如矮牵牛、福禄考、悬钩子等。许多常规方法不能无性繁殖的种类，在试管条件下却能较容易地产生不定芽而再生，如柏科，松科，银杏等一些植物。许多单子叶植物储藏器官能强烈地发生不定芽，用百合鳞片的切块就可大量形成不定鳞茎。在不定芽培养时，也常用诱导或分化培养基，如非洲菊、草莓等。,（,3,）体细胞胚状体的发生与发育,2,继代培养：在初代培养的基础上所获得的芽、苗、胚状体和原球茎等,数量都还不多，它们需要进一步,增殖,，使之越来越多，从而发挥快速繁殖的优势。,继代培养是继初代培养之后的连续数代的,扩繁,培养过程。旨在繁出相当数量的无根苗，最后能达到边繁边生根的目的。继代培养的后代是按,几何级数,增加的过程。,在快速繁殖中初代培养只是一个,必经,的过程，而继代培养则是,经常性不停,的进行过程。但在达到相当的数量之后，则应考虑使其中一部分转入生根阶段。,从某种意义上讲，增殖只是贮备母株，而生根才是增殖材料的分流，生产出成品。,3,生根培养：,生根培养是使无根苗生根的过程。最后要使生出的不定根浓密而粗壮。生根可采用,1/2,或者,1,4,培养基,，全部去掉或用低浓度的细胞分裂素，并加入适量的,生长素,(NAA,、,IAA,等,),。,当新梢高达,3cm,以上时,切除基部的愈伤组织,。用下列方法诱导生根（,1,）将新梢基部浸入,50,或,100ppm IBA,溶液中处理,4,8,小时。（,2,）在含有生长素的培养基中培养,4,6,天。（,3,）直接移入含有生长素的生根培养基中。上述三种方法均能诱导新梢生根。但前二种方法对新生根的生长发育更有利。而第三种对幼根的生长有抑制作用。因为当根原始体形成后较高浓度生长素的继续存在，则不利于幼根的生长发育。,试管内生根壮苗的阶段，目的是为了成功地移植到试管外的环境中，使试管苗适应外界的环境因子。不同植物的适宜驯化,温度,不同。如菊花，以,18,20,为宜。温度过高牵涉到蒸腾加强。以及菌类易滋生等问题。温度过低使幼苗生长迟缓，或不易成活春季低温时苗床可加设电热线使基质温度略高于气温,20,3,，这利于生根和促进根系发达，有利于提前成活。,光强,应比以前培养有所提高。以强度较高的漫射光为好，约,4000Lx,左右为宜，以维持光合作用所需光强。但光线过强刺激蒸腾加强，使水分平衡的矛盾更尖锐。,培养物污染原因和预防措施,1,、污染：是指在组织培养过程中由于真菌、细菌等微生物的侵染，在培养容器内滋生大量的菌斑，使培养材料不能正常生长和发育的现象。污染物的长期存在会引起试管苗生活力下降，叶片缺绿，甚至死亡。,2,、原因：培养基及各种使用器具消毒不彻底，外植体灭菌时不彻底，操作时人为因素带入，工作区域污染等。,3,、控制：器具在高温灭菌后，在使用过程中需要不断地在酒精灯上进行,灼烧消毒,；所使用的外植体在常规的消毒后，可能还带有一定量的菌，可以先在培养基上进行几天的,预培养,，再转到分化培养基上，另外也可以通过在培养基中添加,抗生素,来抑菌。,初代培养外植体的褐变,外植体褐变,是指在诱导脱分化或再分化过程中，自身组织从表面向培养基释放褐色物质，以至培养基逐渐变成褐色，外植体有变褐色而死亡的现象。,原因：,很多植物都含有较多的,酚类化合物,，其在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。在细胞受到伤害时，分隔效应被打破，酚类化合物外溢，与多酚氧化酶接触而氧化成,褐色,的,醌类物质,和水。醌类物质在酶的作用下，与外植体中的蛋白质聚合，从而使其它酶失活，组织代谢活动紊乱，生长停滞。,影响因素,1,、植物种类和基因型：,木本植物、单宁或色素含量高的植物易发生褐变；,2,、外植体的来源和生理状况,：幼龄材料一般比成龄材料褐变轻（含酚类物质少）；同一植物冬春季取材褐变死亡率最低，其它季节不同程度增加；,3,、外植体的大小：,小材料更易褐变，大材料切口越大，酚类氧化面越大，易褐变；消毒的化学试剂也会引起褐化；,4,、培养基：浓度过高的无机盐,会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，,细胞分裂素,的水平过高也会刺激某些花卉外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。,5,、培养条件不当：,例如光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。,控制褐变的措施,1,、外植体和培养材料进行,20-40,天的,遮光处理或暗培养,，可减轻部分种类的褐化程度；,2,、在接种前用无菌水反复清洗外植体并对外植体进行冷藏处理，,洗尽切口处渗出的酚类物质,，可起到减轻褐化作用；,3,、控制温度和光照，在不影响正常生长和分化的前提下，尽量,降低温度，减少光照,；,4,、在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等,抗氧化剂,能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。在培养基中加入,0.5-1%,左右的,活性炭,，用以吸附褐变产生的有害物质，减轻褐变影响；,5,、,连续转移：,对容易褐变的材料可间隔,12,24,小时的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理,7,10,天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。,继代培养时材料的玻璃化,定义：当植物材料不断地进行离体繁殖时，有些培养物的嫩茎、叶片往往会呈半透明状，呈水迹状，这种现象通常称为玻璃化。玻璃化为试管苗的,生理失调症。,玻璃苗的,特点,：叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔；体内含水量高，但干物质叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低。,诱因（,P40,）,1,、激素浓度：当培养基上细胞分裂素水平较高时，容易出现玻璃化现象；,2,、温度,3,、湿度,4,、培养基的硬度,5,、光照时间,6,、培养基成分,C/N,解决的方法,（,1,）增加琼脂浓度，提高蔗糖含量，可增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的水势；,（,2,）减少培养基中含氮化合物的用量；,（,3,）增加光照；,（,4,）增加容器通风，降低培养容器内部环境的相对湿度；,（,5,）降低培养温度，进行昼夜变温交替培养，有助于减轻试管苗玻璃化的现象发生；,（,6,）降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的含量，可以考虑加入适量脱落酸。,试管苗移栽驯化,试管苗移栽是组织培养的重要环节，这个工作环节做不好，就会造成前功尽弃。为了做好试管苗的移栽，应该选择适用合适的基质，并配合以相应的管理措施，才能确保整个工作有条不紊地进行。,必须通过,炼苗,，例如通过控水、减肥、增光、降温等措施，使它们逐渐地适应外界环境，从而使生理、形态、组织上发生相应的变化，使之更适合于自然环境，只有这样才能保证试管苗顺利移栽成功。,从叶片上看，试管苗叶片表面角质层不发达或没有，叶片通常没有表皮毛，或仅有较少表皮毛。叶片上甚至出现了大量的水孔，此外，气孔的数量、大小也往往超过普通苗。由此可知，,试管苗更适合于高湿的环境，当将它们移栽到正常环境中时，试管苗失水率很高，非常容易死亡。,为了要改善试管苗的上述不良生理、形态特点，则必须要经过与外界相适应的驯化处理，通常采取的措施有：对外界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等。,此外，对栽培驯化基质要灭菌因为试管苗是在无菌的环境中生长，对外界细菌、真菌的抵御能力极差。,为了提高成活率，可以在培养基质中掺入,75,的百菌清可湿性粉剂,200,500,倍液，以进行,灭菌处理,。,过程,（一）移栽基质的准备,适合栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，不利于杂菌滋生，可选用,珍珠岩、蛭石、砂子,等。为了增加粘着力和一定的肥力可配合,草炭土或腐殖土,。配时按比例搭配，一般用珍珠岩：蛭石：草炭土为,1,：,1,：,0.5,。也可用砂子：草炭土为,1,：,1,。,这些介质在使用前应,高压灭菌,。或用最少,3,小时烘烤来消灭其中的微生物。要根据不同植物的栽培习性来进行配制，这样才能获得满意的栽培效果。,（二）栽培容器准备,栽培容器可用,66,1010,的软塑料钵，也可用育苗盘。,前者占地大，耗用大量基质，但幼苗不用再移，后者需要二次移苗，但省空间省基质。,（三）移苗和幼苗的管理,从试管取出发根的小苗，用自来水,洗掉根部粘着的培养基,，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。但要轻轻除去，以减少伤根。,栽植时用一个筷子粗的竹签在基质中插一小孔，然后将小苗插入注意幼苗较嫩，要防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，,栽前基质要浇透水。栽后轻浇薄水。,栽后给予,较高的空气湿度条件,。首先营养钵的培养土要浇透水，所放置的床面也要浇湿，然后搭小拱棚，以减少水分的蒸腾，并且初期要常喷雾处理，保持拱棚薄膜上有水珠出现。,当发现小苗有生长趋势，可逐渐减少湿度将拱棚两端打开,通风，并且减少喷水次数。,使小苗适应湿度较小的条件。以后,揭去拱棚的薄膜，并给予水分控制，少浇水或不浇水，,促进小苗长得粗壮。,温度管理上要掌握适宜的,生根温度,，最适宜的温度是,16,20,，春季地温较低时，可用电热线来加温。,光照管理上初期可用较弱的光照，在小拱棚上,加盖遮阳网或报纸等，,以,防阳光灼伤小苗和增加蒸腾作用,，后期可直接利用自然光照。,要注意防止菌类滋生。用一定浓度的杀菌剂可以有效地保护幼苗，如,多菌灵、托布津,等，有死苗现象就是由于杂菌引起的，喷药宜,7,10,天喷一次；喷营养液作追肥，可加快苗的生长与成活；开始给予比较弱的光照。,当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。,只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽的。,