高中生物DNA和蛋白质技术5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段讲义.ppt

,-,*,-,课题,2,多聚酶链式反应扩增,DNA,片段,课题,2,多聚酶链式反应扩增,DNA,片段,二,一,三,一、,PCR,原理,二,一,三,二,一,三,二,一,三,二、,PCR,的反应,过程,二,一,三,二,一,三,三、实验,操作,二,一,三,探究点一,探究点二,问题导引,体内,DNA,复制与,PCR,反应有何异同,?,在遗传病诊断、刑侦破案、古生物学等工作中,有时需要对样品中,DNA,进行测序、鉴定等,但有的样品中,DNA,含量太低而难以对样品进行分析研究,因此常需要用,PCR,技术对采集到的,DNA,样本进行大量扩增。,PCR,技术是利用,DNA,半保留复制的原理,在微量离心管中进行,DNA,的复制,(,如下图,),在很短的时间内,将,DNA,复制出上百万份拷贝。,探究点一,探究点二,(1),PCR,技术中加热使,DNA,双链打开,这一步是打开,氢,键,称为,变性,。如果在细胞中则是在,解旋酶,的作用下使此键断裂。,(2),当温度降低至,55,时,引物在模板,3,端与模板结合,当温度又升至,72,时在,DNA,聚合酶的作用下,合成新的,DNA,链,最终合成,2,个,DNA,分子,此过程中原料是,4,种脱氧核苷酸,遵循的原则是,碱基互补配对原则,需要的酶是,耐高温的,Taq,DNA,聚合酶,。,(3)PCR,技术的必要条件,除了模板、原料、酶以外,至少还需要三个条件,即,:,液体环境、适宜的,温度,和,pH,前者靠,PCR,仪自动调控,后者由,缓冲液,维持。,探究点一,探究点二,归纳提升,体内,DNA,复制与,PCR,的比较,探究点一,探究点二,特别提醒,PCR,反应需可变的温度,而体内,DNA,复制需要稳定的温度。,探究点一,探究点二,问题导引,PCR,反应一般经历多少次循环,?,每次循环有几个环节,?,下图为,PCR,反应过程示意图,据图回答问题。,(1),PCR,一般要经历三十多次循环,每次循环一般包括,A,变性,、,B,复性,和,C,延伸,三步。,(2),第一轮的产物作为第二轮的,模板,参与反应,经过,A,、,B,、,C,三步进入下一轮循环。,探究点一,探究点二,(3),若下图为第一轮循环产生的产物,请绘出以,a,链和,b,链为模板经,PCR,扩增的产物,。,答案,:,(4),假设,PCR,反应中只有,1,个,DNA,分子作模板,第一轮循环的产物,2,个子代,DNA,分子为,N,1,第二轮的产物,4,个子代,DNA,分子为,N,2,N,1,、,N,2,中含有模板,DNA,链的,DNA,分子数量分别为,2,个、,2,个。若继续循环,该模板,DNA,分子经过,30,次循环后能形成,2,30,个,DNA,分子。,探究点一,探究点二,归纳提升,1.PCR,扩增需要注意的问题,(1)DNA,复制需要引物的原因,:DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,而只能从,3,端延伸,DNA,链。,PCR,中,引物长度通常为,2030,个核苷酸。,(2),当,PCR,反应体系的温度冷却到,50,左右时,引物与模板结合,一般不需要考虑解开的两个,DNA,模板链的重新结合,原因是,:,模板,DNA,链比引物长得多而且复杂得多,不易重新结合,;,引物和模板之间的碰撞机会远远高于模板互补链之间的碰撞机会,;,加入的引物的量足够大,而模板链数量少。,探究点一,探究点二,2.,实验中,DNA,含量的测定,DNA,在,260 nm,的紫外线波段有一强烈的吸收峰,可以利用,DNA,的这一特点进行,DNA,含量的测定,具体方法如下。,稀释,:2,L,PCR,反应液,加入,98,L,蒸馏水,即将样,品进行,50,倍稀释,对照调零,:,以蒸馏水作为空白对照,在波长,260 nm,处,将紫外分光光度计的读数调节至零,测定,:,取,DNA,稀释液,100,L,至比色杯中,测定,260 nm,处的光吸收值,计算,:DNA,含量,(,g,/mL)=50(260 nm,的读数,),稀释倍数,类型一,类型二,类型三,类型一,PCR,反应与体内,DNA,复制的比较,【例,1,】,PCR,过程与细胞内的,DNA,复制过程相比较,下列相关叙述正确的是,(,),PCR,过程需要的引物是人工合成的单链,DNA,或,RNA,PCR,过程不需要,DNA,聚合酶,PCR,过程中,DNA,的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的,PCR,过程中,DNA,不需要解旋,直接以双链,DNA,为模板进行复制,A.,B.,C.,D.,类型一,类型二,类型三,解析,:,PCR,过程与细胞内的,DNA,复制过程相比,主要有两点不同,:,第一,PCR,过程需要的引物是人工合成的单链,DNA,或,RNA,其长度通常为,2030,个核苷酸,;,第二,PCR,过程中,DNA,的解旋不依靠解旋酶,而是通过对反应温度的控制来实现的。,答案,:,B,类型一,类型二,类型三,变式训练,1,下列关于体内,DNA,复制和,PCR,的描述中,正确的是,(,),A.DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,只能从,5,端延伸,DNA,链,B.DNA,复制不需要引物,C.,引物与,DNA,母链通过碱基互补配对进行结合,D.PCR,扩增的对象是氨基酸序列,解析,:,由于,DNA,聚合酶不能从头开始合成,DNA,只能从,3,端延伸,DNA,链,故,DNA,复制需要引物,而且它与,DNA,母链通过碱基互补配对结合。,PCR,扩增的对象是,DNA,而不是氨基酸。,答案,:,C,类型一,类型二,类型三,类型二,PCR,反应过程,【例,2,】,下图是,PCR,技术示意图,请回答下列问题。,类型一,类型二,类型三,(1),标准的,PCR,过程每次循环一般分为,、,、,三大步。,(2),引物是,PCR,过程中必须加入的物质,从化学本质上说,引物是一小段,。,(3),将双链,DNA,使之变性,从而使,。,(4),从引物开始延伸,DNA,分子链需提供,作为原料。,类型一,类型二,类型三,解析,:,(1)PCR,过程一般分变性,复性,延伸三大步。,(2),引物的化学本质为一小段单链,DNA,或,RNA,。,(3),将,DNA,加热至,90,以上,可使,DNA,双链分开。,(4),从引物开始延伸,DNA,分子链需提供脱氧核苷酸作为原料以形成,DNA,子链。,答案,:,(1),变性复性延伸,(2),单链,DNA,或,RNA,(3),加热到,90,以上双链,DNA,分开成为两条单链,(4)4,种脱氧核苷酸,类型一,类型二,类型三,变式训练,2,如下,图表示,DNA,变性和复性示意图,下列相关说法不正确的是,(,),A.,向右的过程为加热,(80100,),变性的过程,B.,向左的过程为缓慢冷却复性的过程,C.,变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同,D.,图中双链,DNA,片段共有,2,个游离的磷酸基和,2,个,3,端,解析,:,DNA,体外变性与体内解旋实质是相同的,都是使氢键断裂,但条件不同,DNA,双螺旋打开在体内是解旋酶作用,在体外是高温条件。,答案,:,C,类型一,类型二,类型三,类型三,PCR,实验的操作步骤,【例,3,】,下列有关,PCR,操作过程的叙述,错误的是,(,),A.PCR,实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌,B.PCR,所用的缓冲液和酶应分装成小份,并在,-20,储存,C.PCR,所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后,迅速融化,D.,在微量离心管中添加反应成分时,每吸取一种试剂后,移液器上的枪头都必须更换,解析,:,为了防止外源,DNA,等因素的污染,PCR,实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌,;,所用的缓冲液及酶应分装成小份保存,并使用一次性枪头。在冰箱中放置的缓冲液和酶取出后应放在冰上缓慢融化,而不能迅速融化。,答案,:,C,类型一,类型二,类型三,变式训练,3,PCR,反应的最大特点是具有较强扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生。防止污染的办法不包括,(,),A.,将样品的处理、配制,PCR,反应液、,PCR,循环扩增及,PCR,产物的鉴定等步骤分区或分室进行,B.,吸样枪吸样要慢,每次吸样时尽量一次性完成,枪头、微量离心管应一次性使用,以免交叉污染,C.,所有,PCR,试剂都应放置于大瓶分装,以减少重复加样次数,避免污染机会,D.PCR,试剂、,PCR,反应液应与样品及,PCR,产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一冰箱,答案,:,C,1,2,3,4,1,.PCR,的含义是,(,),A.,亲子代反应技术,B.,多聚酶链式反应,C.DNA,片段复制,D.DNA,序列测定,解析,:,PCR,技术是指多聚酶链式反应,是体外迅速扩增,DNA,片段的技术,该技术利用,DNA,热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合。,答案,:,B,1,2,3,4,2,.,要使,PCR,反应在体外的条件下顺利地进行,需要严格地控制,(,),A.,氧气的浓度,B.,酸碱度,C.,温度,D.,大气的湿度,解析,:,PCR,过程中,DNA,的变性、复性、延伸都是由温度控制的。,答案,:,C,1,2,3,4,3,.,用于,PCR,的引物长度通常为,2030,个核苷酸,是一小段,(,),A.DNAB.RNA,C.,单链,DNA,或,RNAD.,双链,DNA,解析,:,PCR,中的引物是一小段单链,DNA,或,RNA,。,答案,:,C,1,2,3,4,4,.,回答下列有关,PCR,技术的原理与操作的问题。,(1),在,的温度范围内,DNA,的,解体,分开,这个过程称为,。,(2)PCR,反应需要的条件,:,缓冲液、,DNA,模板、引物、,4,种脱氧核苷酸、耐热的,Taq,DNA,聚合酶。其原因是,。,(3),在,PCR,反应中与解旋酶作用相同的步骤是,。,解析,:,PCR,技术利用,DNA,的热变性原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合。在,95,左右,(80100,)DNA,变性,氢键断裂,双螺旋打开,类似于生物体内解旋酶的作用,;,产生单链后,DNA,单链与引物结合,然后利用,4,种脱氧核苷酸,经过延伸,完成,DNA,扩增的一次循环。,1,2,3,4,答案,:,(1)80100,双螺旋结构双链变性,(2)PCR,反应的本质是,DNA,复制,其需要的条件类似于生物体内,DNA,的复制,(3)95,左右,DNA,变性,必背语句,1,.PCR,即多聚酶链式反应,是一种体外迅速扩增,DNA,片段的技术。,2,.PCR,利用了,DNA,的热变性的原理,通过控制温度来控制双链的解聚与结合。,3,.DNA,聚合酶从引物,3,端开始延伸,DNA,链,DNA,的合成方向总是从子链的,5,端向,3,端延伸。,4,.PCR,反应的条件包括,:,一定的缓冲溶液、,DNA,模板、,4,种脱氧核苷酸、耐热的,DNA,聚合酶、两种引物,同时通过控制温度使,DNA,复制在体外反复进行。,5,.PCR,一般要经历三十多次循环,每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。,6,.DNA,在,260,nm,的紫外线波段有一强烈的吸收峰,可以利用,DNA,的这一特点进行,DNA,含量的测定。,