荧光定量PCR的原理及临床应用2(学生讲课HCMV).ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,荧光定量,PCR,的原理及临床应用,苏晓霁,如何做一个“,聪明,”的实习生,实习的目的就是对在校所学的理论知识和实验技能，在临床的实际工作中进行实践、巩固和提高。,如何做到：,实习之前要复习理论知识和实验课内容,“,理论先行,”,实习过程中要“,聪明,”,做好实习笔记，用心思考，,实习之外下功夫,如何做一个“聪明”的实习生,聪,明,耳：认真听老师的说明和讲解,看：仔细看老师的操作,问：有疑问要多提问，多讨论,心：要用心去思考,日月：要每天每月坚持做到,内容概要,PCR,的定义和原理,荧光定量,PCR,的原理和分类,荧光定量,PCR,结果的分析,荧光定量,PCR,在临床的应用,PCR,的定义,PCR,是,Polymerase Chain Reaction,的缩写，中文称为,聚合酶链式反应,，由,变性,、,退火,及,延伸,几步反应组成一个周期,循环进行,可使目的,DNA,得以迅速扩增。,由美国,PE,公司遗传部的,Dr.Mullis,发明，由于,PCR,技术的跨时代意义，,Mullis,获得了,1993,年诺贝尔化学奖。,PCR,的原理,变性,：双链,DNA,在高温下解开成单链的过程,。温度一般为,95,左右。,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,加热,PCR,的原理,退火,：温度下降后，两条配对的单链,DNA,重新结合为双链的过程。温度一般为,50,60,。,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC,GGACTCGACACT,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC,GGACTCGACACT,降温,PCR,的原理,延伸,：,DNA,聚合酶催化以引物为起始点的,DNA,链延伸反应,。温度一般为,72,左右。,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC,GGACTCGACACT,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,3GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT5,CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA,GGTGACGGAGAG GGACTCGACACT,恒温,普通,PCR,的原理,普通,PCR,的原理,PCR,反应成分：,1.,模板,DNA,2.,引物,3.,四种脱氧核糖核苷酸,4.DNA,聚合酶,(,Taq,酶,),5.,反应缓冲液、,Mg,2,+,等,6.,荧光探针（荧光定量,PCR,）,Taq,酶的发现,在,Taq,酶发现之前，实验室的,PCR,反应中运用的是大肠杆菌,DNA,聚合酶,的,Klenow,片段。,Klenow,酶不耐高温，,90,加热后会,变性失活,，每次循环结束都要加入新鲜的酶。,而且,DNA,的延伸是在,37,完成，模板和引物容易错配，造成反应的,特异性很差,。,Taq,酶的发现,美国的嗜热菌研究室在黄石国家公园温泉中发现了嗜热菌,(,T,hermus,aq,uaticus),株，,Cetus,公司研究人员从中分离了,Taq DNA,聚合酶,特点：耐高温：,70 2h,活性,90%,，,93 2h,活性,60%,，,95 2h,活性,40%,；延伸温度较高,(,一般为,72),：大大,提高了扩增特异性、灵敏性和扩增效率,。,荧光定量,PCR,概念：在,PCR,反应中加入,荧光基团,，利用荧光,信号累积或变化实时监测,整个反应过程，最后通过特定数学模型对未知模板进行定量分析的方法。,实时荧光定量,PCR,技术于,1996,年由美国,Applied Biosystems,，,ABI,公司,推出，实现了,PCR,从定性到定量的飞跃。,实时荧光定量,PCR,的原理,利用,荧光信号的变化,实时监测,PCR,反应的每个循环的扩增产物量的变化。,通过,Ct,值,和,标准曲线分析,对起始标本的模板量进行定量分析。,与普通,PCR,的比较,普通,PCR,完成后，一般只对扩增的最终产物量进行分析，分析结果多为,定性或者半定量,结果。,荧光定量,PCR,通过监测荧光值的变化，体现每一个循环的扩增产物量的变化，分析结果为,定量,结果。,与普通,PCR,的比较,普通,PCR,完成后，才能进行扩增产物的分析，而且分析的过程可能产生一定的,生物危害和环境污染,。,荧光定量,PCR,的扩增和产物分析过程是,同时完成,的，而且在,封闭,的反应体系中进行，比较安全，易于处理。,常用的名词概念,本底信号（,Baseline,）,荧光阈值（,Threshold,）,Ct,值（,Ct value,）,扩增曲线,前,15,个循环荧光信号的均值，可手动调节选择,默认是第,3,15,个循环的荧光信号的标准偏差的,10,倍，也可手动调节,扩增过程中，产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数,常用的名词概念,Threshold,Baseline,Ct value,荧光强度,Rn,扩增循环数,对数增长期,实际中的运用,左图为,5,个数量级的标准品扩增后得到的荧光曲线，,右图以,Ct,值为纵坐标，,lgX,s,为横坐标，可计算得出标准曲线,实时荧光定量,PCR,的分类,目前的实时荧光定量,PCR,均是基于,荧光共振能量转移,（,Fluorescence resonance energy transfer,，,FRET,）的原理。,F,Q,10nm,F,Fluorophore,荧光基团,Q,Quencher,，淬灭基团,F,Q,10nm,荧光共振能量转移（,FRET,）发生的条件,荧光基团和淬灭基团都能发射荧光,荧光基团的,发射光谱,和淬灭基团的,激发光谱,需有效重叠,荧光基团和淬灭基团应足够的近（,500bp,片段敏感,75%,或无水乙醇溶液喷雾,荧光定量,PCR,在临床的应用,在反应体系中使用,dUTP,和,UNG,酶消除以往实验的污染影响,UNG,酶（尿嘧啶,-N-,糖基化酶）：选择性水解断裂含有,dU,的双链和单链中的尿嘧啶糖苷键，在碱性介质和高温下会进一步水解断裂，酶的最佳活性温度是,50,，在,95,失活。,荧光定量,PCR,在临床的应用,气溶胶污染物,50 2min,，,95,灭活,加入,UNG,酶,荧光定量,PCR,在临床的应用,5CCACTGCCTCTC CCTGAGCTGTGA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,扩增,加入,dUTP,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,5CCAC,U,GCC,U,C,U,C CC,U,GAGC,U,G,U,GA3,潜在气溶胶污染物,50,2min,加入,UNG,酶,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,5,断裂的核苷酸片段,3,荧光定量,PCR,在临床的应用,乙型肝炎病毒,DNA(,HBV-DNA,),EB,病毒,DNA(,EBV-DNA,),人巨细胞病毒,DNA(,HCMV-DNA,),肺炎支原体,DNA(,MP-DNA,),肺炎衣原体,DNA(,CP-DNA,),临床标本的采集,检 测 项 目,标 本 类 型 及 要 求,HBV-DNA,血清或者血浆,100l(,不可用肝素抗凝,),EBV-DNA,血清,100l,或抗凝全血,1ml(,不可用肝素抗凝,),HCMV-DNA,血清,100l,或抗凝全血,1ml(,不可用肝素抗凝,),MP-DNA CP-DNA,咽拭子、痰液或肺支气管灌洗液,1ml,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,用于器官移植、骨髓移植及,HIV,阳性,/AIDS,患者人巨细胞病毒感染的,辅助诊断和疗效监控,。,临床上可以采用的标本类型：,尿液,、,乳汁,、,血清、血浆或,淋巴细胞,样本中人巨细胞病毒,DNA,。,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,巨细胞病毒,DNA,的提取（血清或血浆）,100l,血清,或血浆,100l,DNA,浓缩液,去除上清液，保留沉淀,12000rpm,，,10min,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,巨细胞病毒,DNA,的提取（血清或血浆）,加入,50l,DNA,提取液,剧烈振荡混匀,5-10s,100,加热,10min,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,巨细胞病毒,DNA,的提取（血清或血浆）,4,放置或用于,PCR,振荡混匀,510s,12000rpm,，,5min,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,巨细胞病毒,DNA,的提取（尿液和乳汁）,1ml,尿液或乳汁,去除上清液，保留沉淀,12000rpm,，,5min,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,巨细胞病毒,DNA,的提取（尿液和乳汁）,加入,50l,DNA,提取液,剧烈振荡混匀,5-10s,100,加热,10min,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,巨细胞病毒,DNA,的提取（尿液和乳汁）,4,放置或用于,PCR,振荡混匀,510s,12000rpm,，,5min,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,人巨细胞病毒,DNA,的提取（淋巴细胞的提取）,1ml,抗凝全血,1ml,生理盐水,0.3ml,淋巴细胞分离液,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,人巨细胞病毒,DNA,的提取（淋巴细胞的提取）,水平离心机,2500rpm,，,15min,淋巴细胞层,吸取淋巴细胞悬液,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,人巨细胞病毒,DNA,的提取（淋巴细胞的提取）,淋巴细胞悬液,去除上清液，保留沉淀,12000rpm,，,5min,人巨细胞,病毒,DNA,定量检测试剂盒,人巨细胞病毒,DNA,的提取（淋巴细胞的提取）,加入,50l,DNA,提取液,剧烈振荡混匀,5-10s,100,加热,10min,人巨细胞病毒,DNA,检测试剂盒,人巨细胞病毒,DNA,的提取（淋巴细胞的提取）,4,放置或用于,PCR,振荡混匀,510s,12000rpm,，,5min,荧光定量,PCR,扩增过程,50,94,2min,5min,93,15s,57,30s,Stage1,Stage2,Stage3,45,1,1,25,1min,Stage4,1,DNA,浓缩液的作用,DNA,浓缩液的成分：,PEG6000,、,NaCl,PEG,（聚乙二醇）的作用：,PEG,与自由水分子结合，同时蛋白质表面的水化膜被夺走，与水分子结合的极性集团转而与多聚物的氧原子或者氢氧根结合，形成蛋白质与多聚物的复合体，从溶液中沉淀析出。,提高低浓度标本的检出率,。,PEG,的浓度与沉淀出的,DNA,片段大小成反比。,DNA,浓缩液的作用,NaCl,的作用：在细胞内,DNA,与蛋白质结合成,脱氧核糖核蛋白,DNP,，而,RNA,与蛋白质结合成为,核糖核蛋白,RNP,在不同盐浓度中二者溶解度不一样。,DNP,在纯水或者,12M,的,Nacl,溶解度较大，在,0.14M,溶解度较低，而,0.14M,中,RNP,溶解度较大，因此,利用,0.14M,可分离,RNP,和,DNP,。,DNA,提取液的作用,DNA,提取液的主要成分：,NP-40,TritonX-100,Chelex-100,EDTA(pH8.0),Tris-HCl(pH 8.0),NaOH,（乙基苯基聚乙二醇）很温和的去垢剂，,1%,浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱,（聚乙二醇辛基苯基醚,）一种非离子性去垢剂，被用来做细胞破膜剂,/,细胞通透剂,（聚苯乙烯二乙烯基苯）提取,DNA,过程中，,Chelex100,能有效除去非核酸有机物,螯合,Mg,、,Ca,等二价金属离子，抑制依赖金属离子的脱氧核糖核酸酶对,DNA,的降解作用,（三羟甲基氨基甲烷）与盐酸按比例混合后形成的一种缓冲液体系，,DNA,在这一体系中呈稳定态,核酸在,pH 59,是稳定的，,pH12/3,会引起双链之间氢键解离而变性,淋巴细胞分离液的作用,人外周血中各种细胞的密度不同，红细胞为,1.093,，粒细胞为,1.092,，淋巴细胞为,1.0740.001,。,淋巴细胞分离液密度为,1.0771.080g/ml,，密度梯度离心法原理是根据各类,血细胞比重的差异,，利用,比重介于某两类细胞之间的细胞分离液,对血液进行离心，使血细胞,按照相应的密度梯度分布于不同的位置,，从而达到分离的效果。,？问？题？,PCR,的中文名称，一般包括哪几个反应过程？,在,PCR,中我们常用到的酶是什么？有什么优点？,荧光共振能量转移的原理？,有效防止和消除气溶胶污染的方法？,在临床血液标本采集中哪种抗凝剂不能使用？,淋巴细胞分离液的作用原理？,