课题3-血红蛋白的提取和分离-(16).ppt

,课题,3,血红蛋白的提取和分离,主讲人：,刘 辉,单 位：,巢湖市,第一中学,蛋白粉,，一般是采用提纯的大豆蛋白、酪蛋白、乳清蛋白（缺乏异亮氨酸）、豌豆蛋白等蛋白，或上述几种蛋白的复合加工制成的富含蛋白质的粉末，其用途是为缺乏蛋白质的人补充蛋白质，也可作为功能添加剂用于食品工业生产中。,国际人类蛋白质组计划,（,HPP,）是继国际人类基因组计划之后的又一项大规模的国际性科技工程。首批行动计划包括由中国科学家牵头的,“,人类肝脏蛋白质组计划,”,和美国科学家牵头的,“,人类血浆蛋白质组计划,”,。,“,人类肝脏蛋白质组计划,”,的总部设在中国首都北京，这是中国科学家第一次领导执行重大国际科技协作计划。,实验设计四个环节：,1,、原理,2,、选材,3,、实验步骤,4,、注意事项,实验原理,思考,分离蛋白质的依据是什么？,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,生物大分子物质分离的原理：,实验选材,血红蛋白的结构有什么特点？,在红细胞的组成中，约,90%,是血红蛋白。它由,四个肽链,组成，包括两个,肽链和两个,肽链。每条肽链环绕一个,亚铁血红素,基团，可携带,一分子氧或一分子二氧化碳,。血红蛋白因含,血红,素而呈现红色。,实验选材,人们用鸡的红细胞提取,DNA,，用,猪、牛、羊,的红细胞,提取,血红蛋白,的原因是什么？,思考,鸡的红细胞具有细胞核，含有,DNA,，便于进行,DNA,的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。,用什么样的材料提取血红蛋白？,思考,如何从中分离出血红蛋白？,血液有哪些成分,?,水 分,固体物质,血液,血浆,血细,胞,白细胞,血小板,红细胞,（最多）,血红蛋白,两个,肽链,两个,肽链,血浆蛋白,无机盐,磷脂,葡萄糖等,四个亚铁红素基团,实验,步骤,红细胞的洗涤,样品处理,粗分离,纯化,纯度鉴定,血红蛋白的释放,分离血红蛋白溶液,透析,凝胶色谱法,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶色谱柱的制作,凝胶色谱柱的装填,样品的加入和洗脱,检测,思考,1,、洗涤的目的是什么？,2,、为什么要低速短时离心？,1.,红细胞的洗涤,血液,100mL,3g,柠檬酸钠,低速离心,2 min,红细胞,血 浆,析出血浆,红细胞,5,倍体积生理盐水,搅拌,10min,重复洗涤,3,次，直至上清液没有黄色,样品处理,1.,红细胞的洗涤,样品处理,2.,血红蛋白的释放,样品处理,目的分析：,蒸馏水的作用是,_,。,加入甲苯的作用是,_,。,充分搅拌的目的是,_,。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,3.,分离血红蛋白,1,、采用什么方法可分离血红蛋白？,2,、离心分层后，各层的成分是什么？,3,、用滤纸过滤，去掉了什么成分？,样品处理,滤纸,过滤,脂类物质,3.,分离血红蛋白,分离过程,红细胞,混合液,高速离心,10min,离心管,烧杯,有机溶剂,血红蛋白,样品处理,还含有很多杂质怎么办？,4.,透析,粗分离,缓冲溶液：,1,、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液,PH,发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。,2,、作用：,能够抵制（）的对溶液的（）的影响，维持,PH,基本不变。,外界的酸或碱,PH,值,缓冲溶液的配制,通常由（）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（）就可以制得（）使用的缓冲液。,1,2,使用比例,在不同,PH,范围内,思考：说出人体血液中缓冲液。,NaH,2,PO,4,/,Na,2,HPO,4,H,2,CO,3,/,NaHCO,3,在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是,磷酸缓,冲液,，目的是利用缓冲液模拟细胞内的,PH,环境，保,证血红蛋白的正常结构和功能。,粗分离,总结,纯化,凝胶色谱法,1,、凝胶：,一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，由多糖类构成如葡聚糖、琼脂糖，具多孔的凝胶就叫分子筛）,2,、概念：,根据被,分离物质的蛋白质相对分子质量的大小,，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,纯化,凝胶色谱法,3,、原理：,当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,4,、具体过程：,凝胶色谱法分离蛋白质的原理：,1,、凝胶色谱柱的制作,打孔挖穴安管覆网纱包插管,2,、凝胶色谱柱的装填,固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡,3,、样品的加入和洗脱,调节缓冲液面滴加透析样品样品渗入凝胶床洗脱收集分装蛋白质,凝胶色谱,操作,1,、凝胶色谱柱的制作,2.凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：,凝胶的前处理：,配置凝胶悬浮液：,计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。,凝胶色谱柱的装填方法：,A,、固定：,将色谱柱装置固定在支架上。,B,、装填：,将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。,注意：,1,、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。,2,、装填凝胶柱时不得有气泡存在：,因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果,。,洗涤平衡：,装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在,50cm,高的操作压下，用,300ml,的,20mmol/l,的,磷酸缓冲液（,pH,为,7.0,）,充分洗涤平衡,12,小时,。,注意：,1,、,液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入,，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。,2,、,不能发生洗脱液流干，,露出凝胶颗粒的现象,。,50cm,高,1.,调液面,2.,加样,3.,再调液面,4.,洗脱,5.,收集,缓冲液,凝胶,3,.样品的加入和洗脱,思考,1,、什么时候开始收集？,2,、如何判断流出来的物质是血红蛋白？,3,、在分离过程中，如果红色区带不是,均匀一致移动，会影响实验结果吗？,如何证明收集到的蛋白就是血红蛋白？,纯度鉴定,电 泳,1,、概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2,、原理：许多重要的生物大分子，如（）等都具有,(),在,(),下，这些基团会带上（）。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（）,移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（）以及分子本身（）、（）的不同使带电分子产生不同的（），从而实现样品中各种分子的分离。,多肽、核酸,可解离的基团,正电或负电,所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,一定的,PH,为了使电泳只受到蛋白质分子大小的影响，而不受带电性质的影响，加入了哪种化学试剂？,纯度鉴定,思考,为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入,(),。,。由几条肽链组成的蛋白质复合体在,SDS,的作用下会解聚成单条肽链，,因此测定的结果只是,(),。,SDS,能与各种蛋白质形成蛋白质,SDS,复合物，,SDS,所,带,负电荷,的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。,因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于,(),。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的多少以及分子的大小等因素。,SDS,单条肽链的分子量,分子的大小,电泳检测结果,总结,1,缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（）基本不变。,A,温度,B pH C,渗透压,D,氧气浓度,2,.,哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（）与氧气的运输有关。,A,血红蛋白,B,肌红蛋白,C,肌动蛋白,D,肌球蛋白,3,血液由血浆和各种血细胞组成，其中（）的含量最多。,A,白细胞,B,血小板,C,红细胞,D,淋巴细胞,B,A,C,6,为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（）。,A.NaCl B.,甲苯,C.,蒸馏水,D.,柠檬酸钠,7,将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为,4,层,，,其中第,3,层是（）,A,无色透明的甲苯层,B,脂溶性物质的沉淀层,C,血红蛋白的水溶液,D,其他杂质的暗红色沉淀物,D,C,8,、记住样品处理中的血红蛋白溶液离心后分层顺序,自上而下,是：,有,机溶剂,-,脂,类物质,-,血,红蛋白溶液,-,红,细胞破碎物沉淀,1,、使用,SDS-,聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于（）,A.,电荷的多少,B.,分子的大小,C.,肽链的多少,D.,分子形状的差异,B,2,、随着人类跨入蛋白质组时代，对蛋白质的研究和应用越来越深入，首先要做的一步是（）,A.,弄清各种蛋白质的空间结构,B.,弄清各种蛋白质的功能,C.,弄清各种蛋白质的合成过程,D.,获得高纯度的蛋白质,D,3,、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是（）,A.,相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质,B.,相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质,C.,相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质,D.,二者根本无法比较,A,4,、下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（）,A,可采集猪血作为实验材料,B,用蒸馏水重复洗涤红细胞,C,血红蛋白释放后应低速短时间离心,D,洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液,A,退出,