基因工程的基本操作程序公开课.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,1.2 基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,一、目的基因的获取,1.目的基因,符合人们需要，能编码蛋白质的基因,2.基因文库 P9,将含有某种生物,不同基因,的许多DNA片断，导入到,受体菌,的群体中，,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,，称为基因文库。,种类,基因组文库,：,含有一种生物的,全部基因,部分基因文库,：,只包含了一种生物的,部分基因,，,如：cDNA文库,某种生物的,全部,DNA,限制酶,DNA片段,DNA片段与载体连接,重组DNA,基因组文库,导入受体菌中储存,基因组文库的构建,生物,某个发育时期,的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组DNA,与载体连接,cDNA文库,反转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存,cDNA文库的构建-,逆转录法：,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,3.获取目的基因的方法,（1）从基因文库中获取,（2）利用PCR技术扩增,（3）人工合成,依据：,目的基因的有关信息。,如：,根据基因的核苷酸序列,基因的功能,基因在染色体上的位置,基因的转录产物mRNA,基因翻译产物蛋白质等特性,（1）从基因文库中获取目的基因,（2）利用PCR技术扩增目的基因,概念：PCR全称为_，是一项,在生物_复制_的核酸合成技术。,原理：_,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,模板DNA,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,50,引物1,引物2,DNA引物,95,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,引物1,引物2,DNA引物,72,Taq酶,Taq酶,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第1轮结束,第2轮开始,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,95,50,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR的基本原理,PCR反应条件,PCR过程,PCR的特点,72,第2轮结束,过程：,a、,变性,（90-95）：双链DNA在受热下，_断裂，形成_,b、,复性,（55-65）：温度降低，,引物,与单链DNA结合，形成局部_。,c、,延伸,（70-75）：在,Taq酶,的作用下，合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,方式：以_方式扩增，即_,条件：前提条件:_,结果：,指数,2,n,短时间内大量扩增目的基因,已知基因的核苷酸序列,DNA复制,PCR技术,场所,解旋方式,酶,PCR,技术扩增与DNA复制的比较,高温,解旋酶,体外复制,主要在细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,（3）人工合成法：,在,基因较小，核苷酸序列已知,的情况下，,可以利用,DNA合成仪,人工合成,化学合成法、反转录法,蛋白质,mRNA,DNA,推测,推测,DNA,DNA合成仪合成,根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,二、基因表达载体的构建（,核心,）,1.目的,A.使目的基因在受体细胞中,稳定存在,并,遗传,给子代,B.同时使目的基因能,表达和发挥作用,2.基因表达载体的,组成,：,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,质粒,目的基因,限制酶,DNA连接酶,重组,DNA,3.基因表达载体的构建过程,（1）用_切割质粒，使其出现切口露出_。,（2）用_切割目,的基因，使其产生_,_。,（3）将目的基因插入质粒的_处，加入_，形成了一个重组DNA分子,限制酶,黏性末端,同种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,三、将目的基因导入受体细胞-,转化,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,稳定,表达,受体细胞,1、将目的基因导入,植物,细胞,（1）,农杆菌转化法,特点:,a.能感染,双子叶,植物和,祼子,植物,对单子叶植物无感染能力,b.Ti质粒的,TDNA,可转移至受体细胞并,整合到其染色体上,Ti质粒,目的基因,构建,表达载体,导入,植物细胞,整合,植物细胞染色体DNA,表达,新性状,转入,农杆菌,（2）,基因枪法,-单子叶植物,（3）花粉通道法,我国转基因抗虫棉就是用这种方法获得,2、将目的基因导入,动物细胞,方法：,显微注射法,程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,3、将目的基因导,入微生物细胞,（1）方法：,Ca,2+,处理法（,增加细胞壁通透性,）,（2）微生物作受体细胞原因：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,（3）过程：,Ca,2+,处理,大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,四、目的基因的检测与鉴定,检测（,分子水平,）:,是否,插入,目的基因,是否,转录,是否,翻译,鉴定,:,个体生物学水平鉴定,（1）检测转基因生物染色体的DNA上,是否插入了目的基因,首先取出转基因生物的基因组DNA；,A 方法:,DNA分子杂交,B 过程:,将含目的基因的DNA片段用,放射性同位素,等作标记,以此做,探针,；,使探针和转基因生物的基因组杂交,若显示出,杂交带,表明目的基因已插入染色体DNA中。,1.检测,基因探针,通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交带，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。,(2)检测目的基因,是否转录出了mRNA,方法:,分子杂交法,过程:,用上述探针和转基因生物的,mRNA,杂交,若出现,杂交带,表明目的基因转录出了mRNA。,（3）检测目的基因,是否翻译成蛋白质,方法:,抗原-抗体杂交,提取,方法抗原-抗体杂交,苏云金杆菌,Bt毒素蛋白,将Bt毒蛋白注射小鼠体内,从小鼠血管抽出血液分离出抗Bt毒素的抗体,抗体,蛋白质,出现杂交带,脱分化,组织培养,2.鉴定（个体生物学水平,）,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,目的基因的表达和检测,抗虫鉴定 抗病鉴定,活性鉴定等,抗原抗体杂交法,DNA-RNA分子杂交法,DNA分子杂交法,受体是否具有,转基因特征,个体水平,目的基因是否翻译,目的基因是否转录,目的基因是否导入,分子水平,方法,检测对象,非编码区,非编码区,编码区,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_的,编码区是间隔的、_的,相同点,都由能够编码蛋白质的_和具有调控作用的_区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,编码区,非编码区,非编码区,mRNA前体,mRNA,单链DNA,cDNA,转录,剪接,逆转录,复制,启动子,终止子,基因,不含,非编码系列,。即不含,非编码区,和,内含子,