基因工程原理.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程原理,Principles of Gene Engineering,2009,年,10,月,20,日,日本三得利公司研发得转基因蓝玫瑰第,2,代产品问世。,Principles of Gene Engineering,这种蓝玫瑰就是三得利公司耗资,30,亿日元培育而成,她们,1990,年就开始开发蓝玫瑰,从蓝三叶草中提取蓝色素基因,将基因转入玫瑰花,培植出蓝玫瑰。这株玫瑰得花瓣中所含得色素为蓝色,纯度接近,100%,。,Principles of Gene Engineering,本 章 内 容,1,基因工程得历史与发展,2,基因工程得基本内容与技术,3,基因工程相关酶学,4,基因工程中得载体与宿主系统,5,目得基因得获得与分离方法,6,外源基因导入宿主细胞,7,重组体得鉴定与分析,8,外源基因在大肠杆菌中得表达,9,外源基因在真核细胞中得表达,10,蛋白质工程,11,基因工程得应用与展望,Principles of Gene Engineering,1,基因工程得历史与发展,主要内容,基因工程得概念与特征,自然界中得基因工程,基因工程简史,基因工程历史上得大事,转基因得安全性,Principles of Gene Engineering,在体外将核酸分子插入载体(病毒、质粒等)构成遗传物质得新组合,并使之参到原来没有这类分子得寄主细胞内,并使之稳定繁殖。,什么叫基因工程,Principles of Gene Engineering,基因工程两大特征,a,跨越物种障碍,创造出大自然中不存在得生物类型,b DNA,片段在寄主体内能够稳定遗传并大量扩增,、,Principles of Gene Engineering,遗传工程(,genetic engineering,),基因操作(,gene manipulation,),基因克隆(,gene cloning,),分子克隆(,molecular cloning,),重组,DNA,技术(,rebinant DNA technology,),与”基因工程”类似得表述方法,Principles of Gene Engineering,农杆菌侵染植物,Principles of Gene Engineering,基因工程就是一门综合学科,Principles of Gene Engineering,最为关键得技术就是,核酸限制性内切酶,与,DNA,连接酶,得发现,她们被称为“,分子剪刀”,与“,分子胶水,”。,大家学习辛苦了，还是要坚持,继续保持安静,Principles of Gene Engineering,基因工程得开路先锋们,Paul Berg,Stanley N.Cohen,Herbert Boyer,Principles of Gene Engineering,2,基因工程得基本内容与技术,2、1,基因工程得基本内容,(,1,)目得基因得获得(基因分离或合成),(,2,)重组分子得形成:将目得基因与能够自我复制并具有选择性标记得载体分子相连接而成,(,3,)把重组,DNA,分子引入到合适得受体(寄主)细胞中进行扩增,(,4,)从繁殖得大量细胞群体中筛选鉴定出含有重组,DNA,分子得受体细胞得克隆,(,5,)从筛选得受体细胞克隆中提取出已扩增得目得基因后,或再克隆到表达载体上导入新得寄主细胞,以便产生人们所需要得物质;或者将已扩增得基因做进一步得分析研究之用。,Principles of Gene Engineering,2、2,基因工程得基本技术,Principles of Gene Engineering,基因工程得主要操作步骤,目的基因的获得,基因与载体的连接,重组子的转化,重组子的筛选鉴定,产 生,新物质,其 他,研 究,Principles of Gene Engineering,3,基因工程相关酶学,3、1,核酸限制性内切酶,3、2 DNA,连接酶,3、3,反转录酶,3、4,其她酶,Principles of Gene Engineering,基因工程中常用得部分酶举例,Principles of Gene Engineering,3、1,核酸限制性内切酶,Principles of Gene Engineering,核酸限制性内切酶,又称为“分子剪刀”,1968,年,大肠杆菌中第一种限制性内切酶被发现,至今已经发现有几百种内切酶,其中应用与基因工程得有几十种之多。而且大部分酶得产生都就是利用基因工程得方法。,Principles of Gene Engineering,限制性内切酶得种类与特点,特性 内切酶,I,内切酶,II,内切酶,III,组成,辅助因子,切割特点,在基因工程中作用,3,种亚基,ATP Mg,2+,S-,腺苷甲硫氨酸,非特异性随机切割,识别位点与切割位点相差,1kb,没有用处,单亚基,Mg,2+,特异性切割,识别位点就是切割位点或在附近,十分有用,2,个亚基,ATP Mg,2+,S-,腺苷甲硫氨酸,比较特异性的切割,识别位点在切割位点上游,24-26 bp,处,用处不大,限制性内切酶,II,简称,限制性内切酶,或,内切酶,Principles of Gene Engineering,限制性内切酶性质,(,1,),识别位点,:,长度一般,4-8 bp,具有回文结构特点。,Principles of Gene Engineering,识别位点一般具有回文结构,(,2,)切割后形成得末端特点:,5,端突出,3,端突出,平端,形成得粘性末端易于再连接,Principles of Gene Engineering,(,3,)内切酶得命名 内切酶得名字由,3,个字母组成,物种属名得第一个大写字母加上种名得前,2,个小写字母,;还可以加上菌株得第一个字母与大写得罗马字母等以示区别。如从流感嗜血杆菌,d,株中分离得到,3,个不同得限制酶,分别命名为,Hind,I,Hind,II,与,Hind,III,等。,Haemophilus influenzae,d,嗜血流感杆菌,d,株,Hind III,Hin,d III,注意前,3,个字母就是斜体,如从流感嗜血杆菌,d,株中分离得到,3,个不同得限制酶,分别命名为,Hind,I,Hind,II,与,Hind,III,等。,(,4,),同裂酶,(isoschizomer):,又叫“,异源同工酶,”,指来源不同,但识别序列一致,而切割得方式相同或不同得酶。,(,5,),同尾酶,(,isocaudamer,):来源不同,识别得靶序列也不同,但就是切割后产生得末端相同得酶。,来源,识别序列,切割序列,同裂酶,(,异源同工酶,),不同,相同,相同或不同,同尾酶,不同,不同,相同,同裂酶与同尾酶比较,Principles of Gene Engineering,3、2 DNA,连接酶,1967,年第一次从细菌中发现,DNA,连接酶,(ligase),后来从噬菌体等中也发现有连接酶存在。又被称为“分子胶水”。,连接机制:,催化相邻得,3-OH,与,5-P,之间形成磷酸二酯键。,Principles of Gene Engineering,常用得,DNA,连接酶:,大肠杆菌得,ligase,:只能连接粘性末段,不能连接平末段;,T4 ligase,:可以连接粘性末段或平末段。,在分子生物学中得应用:用于,DNA,片段之间得连接。,Principles of Gene Engineering,3、3,反转录酶,(,逆转录酶,),(,1,)反转录酶得组成与性质,反转录酶就是一类独特得,DNA,聚合酶,以,RNA,为模板,指导,DNA,得合成。又称为“,依赖,RNA,得,DNA,聚合酶”,。,1970,年由,Temin,等首先在鸟类致病得,RNA,病毒中发现。由一条多肽链组成,但有多种酶得活性。,Principles of Gene Engineering,(,2,)反转录酶在基因工程中得应用,反转录酶在基因工程中最主要得用途就就是,将,RNA,反转录成,DNA,。,Principles of Gene Engineering,反转录酶催化从,RNA,合成,cDNA,Principles of Gene Engineering,3、4,其她酶,DNA,聚合酶,I,反转录酶,T3,T7,SP6 RNA,聚合酶,Taq DNA,聚合酶,聚合酶,末段转移酶,T4,多核苷酸激酶,碱性磷酸酶,修饰酶,绿豆核酸酶,核酸酶,S1,外切酶,III,DNaseI,RNaseA,RNase H,核酸酶,Principles of Gene Engineering,4,基因工程中得载体与宿主系统,4、1,基因工程中载体系统,载体得概念、特征、发展历程与类型,常用得载体类型及其特征,4、2,基因工程中得宿主系统,Principles of Gene Engineering,4、1,基因工程中载体系统,4、1、1,什么叫载体,(vector),载体就就是来源于大肠杆菌或噬菌体等得,DNA,可供外源,DNA,插入并将外源,DNA,导入宿主细胞得片段。,Principles of Gene Engineering,由于单独得外源,DNA,片段不能在细胞内长期存在,所以载体得作用就就是使目得,DNA,能够长期在细胞中存在下去。,这就是因为载体就是一个独立于染色体外得,可以自主复制并遗传得单元。,Principles of Gene Engineering,4、1、2,作为克隆载体得基本条件,a,有自主复制能力(即本身就是一个复制子),或整合到基因组,DNA,中,但仍保持独立。,b,有合适得可供外源基因插入得克隆位点,(,单克隆或多克隆位点,),外源基因得插入不影响其自主复制能力。,c,具备选择标记,以便对重组子进行筛选。这些标记包括对抗生素得抗性、氨基酸得合成酶、噬菌斑形成、产生色素等。,Principles of Gene Engineering,d,除保留必要序列外,载体本身应尽可能得小,便于导入细胞与在细胞内生存繁殖。可以携带一定长度得外源,DNA,片段并有较高得拷贝数。,e,使用安全。可隆载体只能生长在有限得宿主细胞内,在体内不能进行重组,细胞间不能发生转移,不产生有害性状,不能离开工程宿主自由扩散。,f,其她特殊要求。,Principles of Gene Engineering,4、1、3,载体发展得历程,载体得构建发展经历大约,3,个时期:,(,1,)第一阶段:主要依赖天然存在得质粒。如,Cohen,最早使用得,pSC101,。后来对载体进行了一系列得改造,如删除非必需序列、引入标志基因、减少酶切位点等。如,pBR322,就就是经过改造得质粒,使用非常广泛。经过改造,质粒在细菌体内得拷贝数均达到几十以上,甚至上百,上千。,pBR322,成为现今多种质粒得来源。,Principles of Gene Engineering,4、1、3,载体发展得历程,(,2,)第二阶段:,20,世纪,70,年代后期至,80,年代中期。构建出了一大批相对分子量小、拷贝数多、有多种特殊性能得载体。以,pUC,系列载体著名,集中了当时载体得诸多优点。并在此基础上发展出,pUC,载体系列,可以满足多种需要。此外,用于酵母、昆虫、高等动植物基因工程得各种载体也得到了发展。,Principles of Gene Engineering,第三阶段:近期,主要就是借助于一些辅助序列引进一些新得功能,如在,pUC18/19,质粒载体中插入丝状噬菌体,M13,得基因间隔区,其中含有单链复制起点,在,M13,辅助噬菌体帮助下,可以产生单链,DNA,模板,这种载体称为,pUC118/119,。,Principles of Gene Engineering,4、1、4,载体得类型,载体得类型很多,不同得分类方法会有不同得结果。例如:可以根据,DNA,分子克隆得目得分为:克隆载体、穿梭载体、表达载体等;根据使用时载体得宿主细胞类型,也可以分为:原核细胞载体(大肠杆菌载体)、真核细胞(哺乳动物细胞、酵母细胞等)载体等。,Principles of Gene Engineering,克隆载体,:,就是指以繁殖,DNA,片段为目得得载体用于外源基因得重组、克隆、复制与保存。一般分子量较小,在宿主细胞中拷贝数较高,所以外源,DNA,片段可以通过克隆技术大量获得。,穿梭载体,:,就是指那些即可以在原核细胞中又可以在真核细胞中繁殖得载体,因为这类载体含有两种复制起点。,表达载体,:可以使克隆得外源基因在宿主细胞内表达得载体。,Principles of Gene Engineering,1,质粒载体(,plasmid,),质粒就是一种亚细胞得有机体,结构比病毒还简单,没有蛋白质外壳,没有细胞外得生命周期,只能在寄主细胞内独立得增殖,并随着寄主细胞得分裂而被遗传下去。自然界中,不论就是真核细胞还就是原核细胞,不论就是格兰氏阳性还就是格兰氏阴性细菌,甚至就是真菌得线粒体中也有质粒得存在。,(1),质粒 得一般生物学特征,Principles of Gene Engineering,大肠杆菌中得质粒,Principles of Gene Engineering,大肠杆菌中得质粒,绝大部分得质粒由,DNA,组成,就是共价闭合得环状双链分子,质粒大小从,1kb,到,200kb,不等。,质粒存在于细胞质内,独立于染色体外并能自主复制(含有复制起始区),可以稳定地游离于染色体之外,一定时候又可逆地整合到染色体上,或消失;质粒可以通过转化从细菌外部进入细菌内部或在细菌之间迅速传递。,Principles of Gene Engineering,质粒得,DNA,虽然只占到染色体,DNA,得,1-3%,但就是却编码着一些非常重要得基因,赋予所在得寄主一些非染色体控制得性状。包括抗性特征、代谢特性、修饰寄主生活方式等。质粒还编码产生抗菌素基因、芳香族化合物降解基因、糖酵解基因、产生肠毒素基因、重金属抗性基因、产生细菌素得基因、诱发植物肿瘤基因、产生硫化氢基因等几十种基因。这些基因常常赋予细菌一些非常特殊得本领。,质粒,DNA,编码得表型,Principles of Gene Engineering,a,共价闭合环形,(cccDNA),:两条,DNA,保持完整。一般成超螺旋状态,称为,SC,(,supercoiled,)构型。,b,开环,DNA(ocDNA),:两条链中一条完整,另一条有一个或几个缺口,称为,OC,构型。,c,线形分子,(lDNA),:两条链均断裂,分子呈线形,称为,L,型。,环形双链,DNA,质粒分子有,3,种构型,Principles of Gene Engineering,结合型质粒与非结合型质粒:,格兰氏阴性细菌中得质粒可以分为结合型质粒与非结合型质粒。其中,结合型质粒携带除了自主复制所必需得遗传信息外还带有控制细菌结合与质粒转移得基因,所以又叫做“,自主转移质粒,可以在细菌之间转移,还可以带动宿主染色体得转移。非结合型质粒则与之相反。基因工程中采用得质粒就是属于非结合型质粒才能保证基因工程得安全。,Principles of Gene Engineering,质粒得拷贝数:,标准生长条件下每条细菌染色体平均具有得质粒,DNA,数目叫质粒得拷贝数。严谨型复制控制得质粒在每个寄主细胞中只有,1-3,个拷贝,属于低拷贝质粒;松弛型复制控制得质粒在每个寄主细胞内有,10-60,或几百个拷贝得质粒,属于高拷贝数得质粒。质粒得严谨型与松弛型不就是固定得,寄主得种类会改变质粒得类型。,Principles of Gene Engineering,质粒得不亲与性,(inpatibility),:,也叫做质粒得,不相容性,指没有选择压力得情况下,两种亲源关系密切得质粒不能在同一个寄主细胞内稳定共存,其中有一个将被逐渐排斥,(,稀释,),掉,这样得质粒叫做不亲与质粒。由于质粒具有不亲与性,所以我们才能在只带有一种质粒得细菌中分离得到成分单一得质粒,DNA,。,Principles of Gene Engineering,基因工程中使用得质粒载体,天然质粒不能完全符合载体得要求,基因工程中使用得质粒载体都就是经过改造得。但不管怎样,作为载体得质粒都必须含有以下几个元件:,复制基因,(,确保插入得外源基因可以复制,),选择标记,(,抗性标记或生长要求标记,),克隆位点,(,单克隆或多克隆位点,),Principles of Gene Engineering,pBR322,4361 bp,pBR322,质粒就是,1977,年,Bolivar,利用天然质粒改造而来得。长度为,4361bp,pBR322,特点,复制起点,:,保证细胞中质粒得拷贝数维持在,10-20,个拷贝,/,细胞,抗性基因,2,个,:,抗四环素基因与抗氨苄青霉素基因,克隆位点,:,单一得酶切位点,供外源基因插入,分子较小,:,有利于质粒进入细胞中与方便,DNA,操作。,Principles of Gene Engineering,高拷贝数得质粒载体,便于获得大量得克隆得基因产物,例如从,ColE1,与,pMB1,衍生而来得载体,、,低拷贝数得质粒载体,在一些情况下,当想将外源基因产物得量控制在一定水平而避免对寄主细胞造成伤害,、,如,pSC101,pLG338,pLG339,pHSG415,等质粒载体,、,Principles of Gene Engineering,Principles of Gene Engineering,Principles of Gene Engineering,能够使克隆在其中得外源基因在细胞中正常转录并翻译成相应蛋白质得克隆载体叫做表达载体。,表达载体,Principles of Gene Engineering,表达载体必须具备得条件,(1),有强得启动子,可以为宿主得,RNA,聚合酶识别,、,(2),有强得终止作用,;,(3),受控得启动子,(,可诱导型等,)、,(4),起始密码子,ATG,与,SD,序列得距离要适当,便于翻译,、,(5),具有复制起点,;,(6),具有多克隆位点,便于外源基因插入,具有选择性标记等。,Principles of Gene Engineering,表达载体要件,Principles of Gene Engineering,2,噬菌体载体(,phage vector,),噬菌体就是一种目前研究最为透彻得大肠杆菌得双链,DNA,噬菌体,大小为,50kb,左右,实验发现其中有,1/3,左右得,DNA,序列不就是病毒繁殖所必须得,这一段,DNA,序列可以用其她,DNA,序列取代,经过点突变、基因组置换等改造,而发展成,噬菌体载体。,噬菌体载体,Principles of Gene Engineering,特点:,(1),可以容纳比质粒更大得外源,DNA,理论上可以克隆得外源基因大小为,23kb,(实际只有,15kb,左右);,(2),噬菌体转染宿主细胞得效率比质粒转化细菌高,2-3,个数量级。,Principles of Gene Engineering,单链,DNA,噬菌体载体,亲源关系很近得大肠杆菌噬菌体,M13,、,f1,与,fd,都含有单链环状,DNA,长度就是,6400bp,。,M13,进入细菌后,其中得单链,DNA,起模板作用,形成双链得复制型,DNA,(,RF DNA,)。不引起宿主菌得裂解。宿主菌通过一种非溶菌得方式将噬菌体挤出去,每个细胞每个世代可以释放大约,1000,个左右得子代噬菌体。,Principles of Gene Engineering,将,M13,噬菌体得双链得复制型,DNA,(,RF DNA,)改造,可以形成单链,DNA,噬菌体载体。可以,容纳外源基因大小在,1500bp,左右。由于这种,M13,噬菌体可以生产单链,DNA,所以,M13,载体在基因工程中用于单链探针得制备、,DNA,得单链测序与定位诱变等。近年来发展起来得,噬菌体表面展示技术,主要使用得就就是,M13,噬菌体载体。,Principles of Gene Engineering,噬菌粒载体,由单链噬菌体载体与质粒载体结合而成得新型载体,叫做噬菌粒,(phagemid or phasmid),。可以产生单链,DNA,也可以产生双链,DNA,载体分子量小,克隆能力大,使用非常广泛。如,pUC118,与,pUC119,噬菌粒载体,(pUC+M13)、,pBluescript,噬菌粒载体,(,又叫做,pKS/pSK),可以用做体外转录载体使用,用途也十分得广泛,几乎世界上每一个分子生物学实验室都在使用。,Principles of Gene Engineering,3,酵母载体,酵母就是基因工程中使用非常广泛得真核单细胞生物,其中使用得载体一般可以分为三类:,3、1,质粒载体,3、2,整合载体,3、3,酵母人工染色体,Principles of Gene Engineering,a,酵母附加型质粒载体(,YEP,),:来源于野生质粒,大小,6300 bp,长度约为,2,m,又叫做,2m,质粒。就是双链环状,DNA,有一段长度为,599 bp,得反向重复序列而分为两个部分,各有基因得启动子与控制元件。,YEP,就是在,2m,质粒基础上加上酵母核,DNA,与细菌质粒,pMB9,部分序列改造而成得。,3、1,质粒载体,Principles of Gene Engineering,c,酵母着丝粒质粒(,YCP,):,为了克服酵母复制质粒,YRP,传代不稳定得缺点而构建了,YCP,质粒。但就是这种质粒对宿主有毒性,只能以低拷贝数存在。,b,酵母复制质粒(,YRP,):,由大肠杆菌质粒,pBR322,加上酵母染色体得自主复制序列而成,高拷贝,不稳定,转化效率高,但就是多代培养后,拷贝数减少。,Principles of Gene Engineering,3、2,整合载体,整合载体(,intergrating vector,YIP,),就是指不含有酵母得自主复制序列,不能在酵母中独立复制,必须在载体整合到酵母染色体上之后才能使其中得基因得到表达。,3、3,酵母人工染色体,利用酵母载体产生得酵母人工染色体克隆系统可以克隆非常大得,DNA,片段,从而代替噬菌体载体合,cos,质粒载体,克隆外源,DNA,得能力可以达到,1000-2000 kb,(,1-2Mb,),详见下文。,Principles of Gene Engineering,4,植物基因克隆载体,目前用于植物基因转移中所用得载体主要就是植物病毒与其她一些病原体,还有一些细菌携带得特殊质粒。,植物基因转移得病毒载体,单链,RNA,植物病毒(如烟草脆裂病毒,TRV,雀麦草花叶病毒,BMV,),单链,DNA,植物病毒(如番茄金色花叶病毒,TGMV,),双链,DNA,植物病毒,(如花椰菜花叶病毒,CaMV,),使用较多,植物基因工程得质粒载体,来自土壤农杆菌中得,Ti,质粒,可以将外源基因转入单子叶与双子叶植物中。,Principles of Gene Engineering,5,动物基因克隆载体,哺乳动物细胞病毒载体,人工构建得哺乳动物细胞载体应该具备得条件就是:,(,1,)含有大肠杆菌复制子与抗性标记;同时含有真核细胞选择标记;,(,2,)含有哺乳动物细胞启动子与增强子元件,可以使外源基因有效转录;,(,3,),RNA,聚合酶,II,所需要得转录终止含有终止信号与,polyA,结构;,(,4,)含有可选择得剪切信号;,(,5,)含有一个以上得多克隆位点。,Principles of Gene Engineering,猿猴空泡病毒,40,(,SV40,),乳头状瘤病毒,昆虫杆状病毒,反转录病毒,痘苗病毒,RNA,病毒,腺病毒,等等,常用得载体举例:,Principles of Gene Engineering,人工染色体,YAC,(,yeast artificial chromosome,),酵母人工染色体,PAC,(,P1 artificial chromosome,),噬菌体,P1,人工染色体,BAC,(,bacterial artificial chromosome,),细菌人工染色体,Principles of Gene Engineering,由于一些基因过于庞大,在构建基因文库时需要能够容纳更大得外源,DNA,片段得载体。随着人们对染色体结构得认识与其中重要序列功能得深入了解,并将其中起作用得重要功能区缩小到了几百碱基对并分离了这些基因。人们将染色体得重要区段分离出来并与普通得质粒相衔接,构成能够容纳特别巨大得,DNA,片段得载体,即人工染色体。,染色体上有,3,个部分最为重要与关键:,着丝粒,(centromere,CEN),、,端粒,(telomere,TEL),与,自主复制序列,(autonomously replicating sequence,ARS),Principles of Gene Engineering,1987,年,David Bruke,等人采用酵母克隆系统,发展出了酵母人工染色体作为克隆得载体,单个,YAC,最大可以容纳外源,DNA,得长度达,1-2Mb(1000-2000 kb),。人类基因组计划中人得基因组文库构建时就就是采用,YAC,作为载体。,YAC,上除了具有上面提到得,着丝粒、端粒,与,自主复制序列,外,还具有正常质粒得元件,包括选择标记、多克隆位点、原核复制起点序列等。,