第9章酶促反应动力学.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第九章：酶促反应动力学,主 要 内 容,底物浓度对酶促反应速率的影响,酶的抑制作用,温度对酶促反应的影响,pH对酶促反应的影响,激活剂对酶促反应的影响,9.1 底物浓度对酶促反应速率的影响,酶促反应中,如果S大大过量,V与E的关系如何？,实际情况下，E稳定，而S变化，V与S的关系如何？,S+E=P+E,9.1.1 中间络合物学说,1903年Henri用蔗糖酶水解蔗糖实验研究底物浓度与反应速率的关系。,S,为解释此现象，提出了中间络合物学说,S+E,ES P+E,A,B,C,1913年，Michaelis and Menten根据中间复合物学说提出米氏方程。,S,+,P,E,ES,E,+,Ks,k,SE,ES分解为产物的逆反应忽略不计,=,V,max,S,Ks+S,1925年，Briggs and Haldane提出了稳态理论，对米氏方程做出了重要的修正。,E +S,ES,k1,k2,ES,E +P,k3,k4,（1）,（2）,ES不仅与（1）有关，也与(2)有关。,9.1.2 米氏方程的推导,达到动态平衡时，ES生成与分解速率相等：,k,1,(E-ES)S,=k,2,ES+k,3,ES,（E-ES）S,ES,=,k,2,+k,3,k,1,=Km,ES=,ES,Km+S,(3),9.1.2 米氏方程的推导,因为酶反应速率（,）与ES成正比，即,=k,3,ES,=k,3,ES=k,3,ES,Km+S,代入方程（3）得：,由于反应系统中SE，当酶全部被饱和形成ES时，E=ES,酶促反应达到最大反应速率Vmax，即Vmax=k,3,ES=k,3,E,=,V,max,S,Km+S,9.1.2 米氏方程的推导,9.1.2 米氏方程的推导,根据米氏方程：,（1）当SKm时，v=Vmax，此条件下可正解测得酶活力,（3）当S=Km时，v=Vmax/2,v=,VmaxS,Km,=K S,9.1.3 Km的意义,1、Km是酶的特性常数,Km的大小只与酶的性质有关，而与酶浓度无关，但与底物、,温度、pH及离子强度有关。,2、Km可判断酶的专一性和天然底物,Km最小的底物称为该酶的最适底物或天然底物。1/km近似,表示酶与底物的亲和力。,3、当k3k2时，Km=k2/k1，Km=Ks,（解离常数），严格地,说是1/Ks表示酶与底物的亲和力，当k3极小时，1/Km才表示,酶与底物的亲和力。,9.1.3 Km的意义,酶 底物Km/moLL,-1,谷氨酸脱氢酶 谷氨酸 1.2,10,-4,-,酮戊二酸 2.0,10,-3,NAD,+,2.5,10,-5,NADH 1.8,10,-5,丙酮酸羧化酶 丙酮酸 4.0,10,-4,HCO,3,-,1.0,10,-3,ATP 6.0,10,-5,9.1.3 Km的意义,4、已知Km可求在某一底物浓度时的反应速率,如当S=4Km时，V=80%Vmax；,当S=10Km时，V=91%Vmax,5、Km可帮助推断某一代谢反应的方向和途径,丙酮酸,乳酸脱氢酶,丙酮酸脱氢酶,丙酮酸脱羧酶,丙酮酸,丙酮酸,乳酸 Km=1.7,10,-5,乙酰辅酶A Km=1.3,10,-3,乙醛 Km=1.0,10,-3,9.1.4 Vmax和K,3,的意义,1、在一定酶浓度下，酶对特定底物的Vmax也是一常数。,同一种酶对不同的底物的Vmax不一样，pH、温度和离,强度等也会影响Vmax的值。,2、当S很大时，Vmax=k,3,E，k,3,是一级反应速率常数；,因此k,3,表示当酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底,物的分子数，又称转换系数（TN）或催化常数（Kcat）,Kcat越大，表示催化效率越高。,9.1.4 Vmax和K,3,的意义,3、生理条件下,S K,m,，,V,max,=k,cat,E,代入米氏方程 v=k,cat,E S/K,m,+S=k,cat,E S/K,m,得出：v=k,cat,/K,m,ES,k,cat,/K,m,为E和S反应形成产物的表观二级速度常数，单位：L/mol s。,k,cat,/K,m,大小可以比较不同酶或同一种酶催化不同底物的催化效率。,9.1.5 Km和Vmax的求法,Lineweaver-Burk双倒数作图法,Eadie-Hofstee作图法,Hanes-Woolf作图法,Eisenthal&Cornish-Bowden,直接线性作图法,9.1.5 Km和Vmax的求法,双倒数作图法,0,9.1.5 Km和Vmax的求法,Eadie-Hofstee作图法,0,9.1.5 Km和Vmax的求法,Hanes-Woolf作图法,S,9.1.5 Km和Vmax的求法,直接线性作图法,例题,为了确定某酶的催化反应的初速度的底物依赖关系，制备了一系列的l00ml含有不同底物浓度的反应混合物。向每个混合物加入相同量的酶后便开始反应。通过测定每单位时间（分钟）所形成的产物量而获得催化反应的初速度，其结果如下表所示。,底物浓度(mol/L),110,6,510,6,110,5,110,4,110,3,110,2,初速度 (mol/min),0.08,0.25,0.33,0.48,0.50,0.50,把表中的数据绘制成图，在给出的酶量下的Vmax是多少?,根据米氏方程，用Vmax、和S推演出Km的代数表达式。计算每个反应混合物的Km。Km值取决于底物浓度吗?,当底物浓度为0.1molL,1,和ll0,7,molL,1,时，计算它们的初速度。,反应混合物保温2分钟后确定反应的初速度。当初始底物浓度为110,2,molL,1,时，计算产物的生成量。在2分钟后底物总量的百分之几被转换?,9.2 酶的抑制作用,酶的失活与抑制的区别,酶抑制程度的表示方法,酶抑制作用的类型,可逆与不可逆抑制作用的鉴别,可逆抑制作用动力学,一些重要的抑制剂,9.2 酶的抑制作用,9.2.1 酶的失活与抑制的区别,凡是使酶蛋白质变性而引起酶活力丧失的作用称为,失活作用,；由于酶必需基团化学性质的改变，但酶未变性，而引起酶活力的降低或丧失而称为,抑制作用,。,9.2.2 酶抑制程度的表示方法,相对活力分数,相对活力百分数,抑制分数,抑制百分数,a=,vi,vo,a%=,vi,vo,100%,i=1-a=1-,vi,vo,i%=(1-a),100%=(1-),100%,vi,vo,9.2.3 酶抑制作用的类型,不可逆抑制作用（,Irreversible inhibition,）,抑制剂与酶的必需基团以共价键相结合引起酶活力丧失，不能用透析、超滤等物理方法去除抑制剂的影响。,可逆抑制作用（,R,eversible inhibition,）,抑制剂与酶的必需基团以非共价键相结合引起酶活力下降或丧失，能用物理方法去除抑制剂的影响。它分为三种：竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。,酶的竞争性抑制作用,大部分竞争性抑制剂（,competitive inhibitor,）与底物结构类似，因此能与酶活性部位结合，与酶形成可逆的EI复合物，但EI不能分解成产物P，酶反应速率下降，它可以通过增加底物浓度而解除。,如丙二酸和戊二酸是琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂,。,E +S,ES P+E,+I,EI,P+E,酶的竞争性抑制作用,酶的竞争性抑制作用,酶的非竞争性抑制作用,E +S,ES P+E,+,I,EI +S,ESI P+E,+,I,底物和抑制剂同时和酶结合，两者无竞争作用。I与S结构无共同之处，酶活性降低或被抑制，不能用增加底物浓度来解除抑制。,酶的非竞争性抑制作用,酶的反竞争性抑制作用,酶只有与底物结合后才能与抑制剂结合。,L-Phe，L-Arg等对碱性磷酸酶的作用是反竞争性抑制，肼类化合物抑制胃蛋白酶、氰化物抑制芳香硫酸酯酶的作用也属此类。,9.2.4 可逆与不可逆抑制的鉴别,9.2.5-竞争性抑制作用动力学,E=E,f,+ES+EI,Vmax=k,3,E v=k,3,ES,Vmax,v,=,E,f,+ES+EI,ES,Km=,E,f,S,ES,E,f,=ES,Km,S,Ki=,E,f,I,EI,EI=E,f,I,Ki,9.2.5-竞争性抑制作用动力学,9.2.5-非竞争性抑制作用动力学,9.2.5-反竞争性抑制作用动力学,9.2.5-Dixon作图法求Ki,9.2.6 一些重要的酶抑制剂,不可逆抑制剂：,非专一性抑制剂：有机磷化合物、有机汞砷化合物、,重金属盐、氰化物、硫化物、CO、青霉素等,专一性抑制剂：TLCK（对甲基苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮）,-,卤代-D-Ala是丙氨酸消旋酶的抑制剂,可逆抑制剂：,磺胺药（如对氨基苯磺酰胺）,9.2.6 一些重要的酶抑制剂,二异丙基氟磷酸：抑制胆碱酯酶活性，使乙酰胆碱不能被分解成乙酸和胆碱，引起乙酰胆碱的积累，使神经处于过渡兴奋状态，因此此类化合物又称神经毒气。,9.2.6 一些重要的酶抑制剂,有机磷化合物：抑制蛋白酶或酯酶活性,敌敌畏,敌百虫,萨林,9.2.6 一些重要的酶抑制剂,有机砷化合物：与酶的巯基结合而抑制活性,路易斯毒气,9.2.6 一些重要的酶抑制剂,苯甲脒是胰蛋白酶的竞争性抑制剂,苯甲脒,9.2.6 一些重要的酶抑制剂,对氨基苯磺酰胺是二氢叶酸合成酶的竞争性抑制剂,（在细菌中催化对氨基苯甲酸合成二氢叶酸）,对氨基苯甲酸,对氨基苯磺酰胺,磺胺类药物可与对氨基苯甲酸竞,争二氢叶酸合成酶，影响FH2的,合成，导致细菌生长繁殖受抑制，,达到治病效果。,9.2.6 一些重要的酶抑制剂,过渡态底物类似物作为酶的竞争性抑制剂,腺苷,次黄嘌呤腺苷,羟化嘌呤核苷,9.2.6 一些重要的酶抑制剂,过渡态底物类似物作为酶的竞争性抑制剂,酵母醛缩酶反应,磷酸乙二醇羟胺,9.3 温度对酶反应的影响,最适温度,受诸多因,素影响,温度系数Q,10,：2左右,温度升高反应速率加快，但过高酶蛋白变性,9.3 温度对酶反应的影响,1,min incubation,10,min incubation,9.4 pH对酶反应的影响,1、影响酶蛋白构象，甚至失活,2、影响底物、酶、中间产物的,解离状态,3、影响侧链基团的解离，从而,影响酶活性中心,9.4 pH对酶反应的影响,木瓜蛋白酶,胃蛋白酶,胰蛋白酶,胆碱酯酶,9.5 激活剂对酶反应的影响,酶激活剂,：简单有机物或无机小分子，如Mg,2+,是多数激酶及,合成酶的激活剂，Cl,-,是唾液淀粉酶的激活剂。,激活剂对酶的作用具有选择性,：Mg,2+,对脱羧酶有激活作用而,对肌球蛋白三磷酶却抑制作用。,离子之间有拮抗作用,：Na,+,抑制K+激活的酶，Ca,2+,抑制Mg,2+,激,活的酶。,Cys、GSH等还原剂,对某些巯基酶有激活作用，使二硫键还原,成巯基提高酶活性。,本章总结,影响酶促反应速率的因素：,底物浓度；,酶浓度；,抑制剂；,pH;,温度；,激活剂；,米氏方程：,方程推导；,参数求解；,抑制剂酶促动力学,