第五章-蛋白质的定性定量检测.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第五章 蛋白质的定性定量检测,第一节 免疫组织化学的基本理论,第二节 蛋白质的定量检测,第三节 免疫印迹法分析特定蛋白质的相对含量,第四节 酶联免疫吸附试验（ELISA）,一、,形态学研究的方法,（S）,二、,组织化学,三、,免疫组织化学,第一节 免疫组织化学的基本理论,一、形态学研究的方法,（S）,（一）普通光镜术,（二）特殊光镜术,1.荧光显微镜,2.相差显微镜,3.暗视野显微镜,4.激光扫描共聚焦显微镜,（三）电镜术,1.透射电镜术,2.扫描电镜术,3.冷冻蚀刻术,（四）组织（细胞）化学术,（五）免疫组织(细胞)化学术,（六）原位杂交,（七）细胞培养术,（八）活体与活细胞染色,（九）形态研究的定量术,1.常规方法：,苏木素（Hematoxylin）-伊红（Eosin）染色法/HE染色,2.特殊染色:,（一）普通光镜术,（S）,HE染色,心肌细胞光镜图,小脑皮质神经元镀银染色,（三）电镜术,（,S,）,1.透射电镜术,2.扫描电镜术,3.冷冻蚀刻术,浆细胞透射电镜图,血细胞扫描电镜,图,（四）组织（细胞）化学术,（五）免疫组织（细胞）化学术,（六）原位杂交,（S）,探针：,DNA,、,RNA,、寡核苷酸（,ODN,）,标记物：放射性核素；非放射性,显示：放射自显影；免疫组化,（七）细胞培养术,（S）,（八）活体与活细胞染色,（S）,1.形态计量术（体视学）,2.显微分光光度术,3.图像分析术,4.流式细胞术,（九）形态研究的定量术,（S）,二、组织化学（histochemistry）,组织化学（,histochemistry,）：,以组织学为基础，应用物理和化学的技术方法显示细胞组织结构中的各种化学成分，并对这些物质进行定位、定性和定量，从而分析研究生物体在生理或病理状态下细胞和组织代谢、功能及形态变化规律的科学。,细胞化学技术,能够对细胞内的各种成分进行定性、定位、定量研究，包括悬浮胸腹水细胞、血液细胞以及体外培养细胞均能产生同样良好的效果。,目前，用细胞化学技术所能显示的化学成分有,蛋白质,（显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基）、,RNA,、,DNA,、,糖类,（如糖原、粘多糖和糖脂等）、,脂类,（如中性脂肪、磷脂和固醇等）、,酶,（如磷酸酶）、,特异抗原,（其化学本质可能是多肽、蛋白、糖蛋白等）、,无机盐,和,微量元素,（如铁、铜、锌、镁等）。,细胞化学技术,（,S,）,细胞化学染色,（,S,）,原理：,细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反应，形成于显微镜下可见到的反应产物。常见的有：,1.,孚尔根反应法,（Feulgen reaction）：显示,DNA,呈现紫红色。,2.,甲绿-派郎宁法,（Methyl Green-Pyronin method）：显示核酸（甲绿染,DNA,呈现绿色，派郎宁染,RNA,呈现红色）。,3.,苏丹冰冻切片染色,：显示,中性脂肪,呈现橘红色。,4.,普鲁士蓝反应,：显示组织中,含铁血黄素,。,5.,过碘酸雪夫反应,（Periodic acid schiff reaction，PAS）：显示,糖原和其它多糖物质,为紫红色。,PAS,苏丹染色,三、免疫组织化学（immunohistochemistry）,（一）,免疫组织化学的概念,（二）,免疫组织化学的简要步骤,（三）,抗原-抗体反应,（四）,免疫标记化学反应与检测,（五）,常用免疫组织化学染色方法,（六）,免疫组组织化学在临床病理诊断中的应用,（S）,免疫组织化学,：,免疫学与组织化学相结合的一个分支学科，以免疫学的抗原,-,抗体反应为基础的理论，其可作为蛋白质定位、定性及半定量检测的方法之一。,免疫组织化学已被广泛应用于基础科学研究和临床诊断中。,（一）免疫组织化学的概念,（二）,免疫组织化学的简要步骤,1.抗体（anbibody，Ab）的制备,（1）抗原的提取和纯化,（2）免疫动物制备多克隆抗体或细胞融合制备单克隆抗体,（3）抗体效价检测和纯化,（4）标记复合物的制备,2.抗原（antigen，Ag）的检测,（1）细胞或组织切片的制备,（2）免疫组织化学反应和显色,3.结果观察和记录,抗原的提取与纯化,免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化,标记物复合物的制备,标本的处理,抗原抗体反应和呈色反应,观察和记录结果,（三）抗原-抗体反应,抗原-抗体反应：,由抗原物质刺激机体产生相应的特异性抗体后，抗原和其特异性的抗体在体内或体外发生结合反应的过程。,利用抗原、抗体在体外可以发生特异性结合反应的特点，将其应用到细胞组织化学中，可对各种抗原或生物活性物质进行分离及检测。,（四）免疫标记化学反应与检测,免疫标记化学反应,：用荧光素等发光剂、酶等呈色物或放射性核素等作为示踪物标记抗体分子，在适宜的条件下（即适宜的温度和pH等），标记抗体与抗原发生特异性的反应。,常用标记物,1.荧光素,（1）异硫氰酸荧光素,（Fluorescein isothiocyanate，,FITC,）：绿色荧光；,（2）四乙基罗达明,：橙红色荧光；,（3）,四甲基异硫氰酸罗达明,：橙红色荧光；,（4）,藻红蛋白,：红色荧光,2.酶,（1）辣根过氧化物酶,（horseradish peroxidase，,HRP,）；,（2）碱性磷酸酶,（alkaline phosphatase，,AP,）,3.金属标记物,：如胶体金，多用于免疫电镜。,4.放射性核素,：涉及污染，防护难，一般不用。,检 测,酶等呈色物,与一定的底物结合后，可以形成具有特殊颜色的化合物，即可知道呈色物标记的抗体与相应的抗原形成的复合物的存在情况。,荧光物质,可以在高压汞灯的激发下，发出特定颜色的荧光，可以在荧光显微镜下被观察到。,胶体金颗粒,可以在透射电子显微镜（,t,ransmission,e,lectron,microscope,，,TEM,）,下观察。,放射性同位素,可以使胶片感光，经放射自显影后就可以知道标记抗体与抗原反应的情况。,毛细血管内皮细胞呈vWF阳性（荧光素标记）,海马细胞,微管蛋白 绿色(胞体、树突),轴突终末蛋白 红色(突触),培养的成纤维细胞,（微管呈绿色，核呈蓝色）,胰岛B细胞呈胰岛素阳性（辣根过氧化物酶标记）,上皮细胞膜MAM-6蛋白电镜图示,（胶体金标记）,（五）常用免疫组织化学染色方法,1.直接法,2.间接法,3.PAP法,4.APAAP法,5.ABC法,6.SABC法,7.LSAB法,8.SP法,9.SAP法,1.直接法,将荧光素或酶直接标记在第一抗体上，以检测相应的抗原。,优点：,简单；时间短；,特异性强。,缺点：灵敏度低，,耗费抗体多,。,直接法,2.间接法,先用荧光素或酶标记第二抗体，一抗为特异性抗体，二抗仅有种族特异性。,特点：,（,1,）较直接法灵敏。,（,2,）,可标记一种抗体，检测多种抗原。,间接法,先将过氧化物酶（,HRP,）免疫兔,/,羊,/,鼠，制成兔,/,羊,/,鼠抗,HRP,抗体；然后再与,HRP,结合，形成,PAP,复合物,。,特点：,（,1,）,敏感性较高；,（,2,）,背景染色低（相对）；,（,3,）所染标本可长期保存。,3.,过氧化物酶-抗过氧化物酶法（,Peroxidase anti-peroxidase method，PAP,）,PAP的原理示意图,4.碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶法（alkaline phosphatase anti-alkaline phosphatase method，APAAP法）,APAAP法检测淋巴细胞亚群,美籍华人,Hsu,于,1981,年首次报道。该法以卵白素作为桥，把生物素化的抗体（二抗）与生物素结合酶（如,HRP,标记的生物素）连接起来。,5.亲和素-生物素过氧化物酶复合物法（avidin biotin-peroxidase complex，ABC）,生物素,/,维生素,H,：,它经过羟基丁二酰亚胺活化为生物素,-N-,羟基丁二酰亚胺酯（,BNHS,），,其酯键可与抗原（,Ag,）、抗体（,Ab,）、酶以及核酸的氨基、羧基或糖基共价结合，达到很高的比活性（即一个大分子上可以连接多个生物素分子）。,生物素（biotin）/维生素H,（S）,亲和素（,avidin,）,/,卵白素,/,抗生物素蛋白：,碱性糖蛋白,，分子量,68,kDa,，,由,4,个相同的亚基组成，每个亚基可以与一分子生物素结合。它对生物素的亲和力很强，比抗原抗体的结合力高,1,万倍以上。,链霉亲和素（,streptavidin,，,SA,）,/,链霉卵白素：,链霉菌培养过程中的分泌产物，是一种,非糖基化的酸性蛋白,。它是一个四聚体蛋白，提供,4,个生物素结合位点。,SA,特异性更高，而且可以耐受较高的盐浓度（如,2 mol/L,KCl,）,和较强的变性剂（如,1%SDS,）。,亲和素和链霉亲和素,（S）,ABC复合物的制备,ABC法的优点,（1）灵敏度较PAP法提高2040倍。,（2）一抗和二抗可高度稀释，使背景染色下降。,6.SABC法,（Streptavidin Biotin-peroxidase Complex）：将ABC复合物中的卵白素换成链霉亲和素。,7.LSAB法,（labelled Streptavidin-Biotin）：将链霉亲和素和生物素先连结起来。,8.SP法,（Streptavidin Peroxidase conjugataed method）：将链霉卵白素和辣根过氧化物酶直接偶联在一起。,9.SAP法,（streptavidin alkaline phosphatase conjugataed method）：将链霉卵白素和碱性磷酸酶直接偶联在一起。,（六）免疫组化在临床病理诊断中的应用,（S）,标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度,协助肿瘤良恶性的诊断,鉴别低分化癌和肉瘤,鉴别转移癌的性质,协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶,鉴别小细胞恶性肿瘤,癌组织耐药基因的检测,为癌症患者治疗方案的拟定提供依据,确定肿瘤组织的增殖活性,评估癌症患者的预后,检测病原体,第二节 蛋白质的定量检测,一、,凯氏定氮法,二、,双缩脲法,三、,Folin-酚试剂法（Lowry法）,四、,紫外分光光度法,五、,考马斯亮蓝G-250染色法,六、,BCA法,一、凯氏定氮法,1983,年由丹麦化学家,凯道尔,建立，以后经过改良使其更符合蛋白质定量的要求。,理论基础：,各种蛋白质的含氮量很接近，通常占其总重量的,16,左右。,蛋白质样品用浓硫酸消化后，可以转变为硫酸铵，硫酸铵中的,NH,4,+,与,NaOH,反应又可转变为,NH,3,，用硼酸液吸收后，可由标准盐酸滴定并定量。,由于蛋白质是体内的主要含氮物，因此，通过测定生物样品的含氮量便可估算出样品中的总蛋白质含量。,蛋白质含量含氮量,6.25,此方法的测定范围为,0.2,1.0 mg,氮。,二、双缩脲法,原理：,蛋白质含有两个以上的肽键，故有双缩脲（,NH,2,-CO-NH-CO-NH,2,）,反应。在,碱性条件,下，肽键的质子被解离，,Cu,2+,和失去质子的多肽链的氮相结合产生稳定的,紫色络合物,，在,540,560 nm,的光吸收值与蛋白质的含量在一定范围内呈线性关系。,双缩脲法的具体操作参见,P144145“,双缩脲法测定蛋白质浓度,”,。,显色反应仅与肽键数呈正比关系，与蛋白质的种类、分子质量及氨基酸组成无明显关系。,Cu,2+,与氨基酸（,Arg,除外）和二肽均不发生反应，仅和,1-,亚氨基缩脲、,2-,亚氨基缩脲、丙二酰胺等少数几种物质有呈色反应。,基本上可以认为,双缩脲反应是蛋白质特有的反应。,1951,年由,Lowery,建立，是目前应用较广泛、,灵敏地,测定蛋白质含量的方法,之一。,原理：,蛋白质在碱性条件下与,试剂甲（双缩脲试剂）,中的,Cu,2+,形成络合物。由于蛋白质含芳香族氨基酸残基（如,Tyr,和,Trp,），生成的络合物可还原,试剂乙（,Folin,-,酚试剂）,中的,磷钼酸,和,磷钨酸,而产生钼蓝和钨蓝复合物，该复合物显,蓝色,，其颜色深浅与蛋白质浓度在一定范围内呈线性关系，可用于定量分析。,三、Folin-酚试剂法/Lowry法,（P145146）,Folin-酚试剂法注意事项,Folin-酚试剂只在酸性溶液中稳定，但本实验在pH10条件下发生，因而,加入Folin-酚试剂后立即混匀,，使Folin-酚试剂在被破坏之前就发生反应。,优点：此法较双缩脲法灵敏。,缺点：,较费时。（,P54,）,标准曲线的直线不太好。（,P54,）,此法干扰物质较多。例如琥珀酸缓冲液、,Tris,缓冲液；螯合剂（,EDTA,等）；糖类（葡萄糖、蔗糖等）；还原剂（酚、,-,巯基乙醇等,）、去垢剂（,Triton,等）；尿素；硫酸铵；三氯乙酸等。,Folin-酚试剂法的优点和缺点,四、紫外分光光度法,由于蛋白质中的,Tyr,、,Trp,和,Phe,残基含有共轭双键，蛋白质溶液在,275280 nm,处有一紫外吸收高峰。在一定浓度范围内，蛋白质的A,280,与其浓度呈正比，据此可进行蛋白质定量测定。,五、考马斯亮蓝G-250染色法/Bradford法,1976,年由,Bradford,建立。,原理：,考马斯亮蓝,G-250,在酸性溶液中以游离态存在时呈,棕红色,，它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为,蓝色,。色素对可见光谱的最大吸收值从,465 nm,转移到,595 nm,处。,蛋白质与色素的结合反应很快速，约在,2 min,左右的时间内达到平衡，在室温,1 h,之内是稳定的。在,0.01,1.0 mg,蛋白质,/,mL,范围内，蛋白质含量与,OD,595,值呈正比。,考马斯亮蓝,G-250,染色法的具体操作参见,P146147“Bradford,检测法”,。,六、BCA法,原理：,BCA（bicinchoninic acid）是对一价铜离子（Cu,+,）敏感、稳定和高特异性的试剂。在,碱性溶液中,，蛋白质将Cu,2+,还原成,Cu,+,，后者与测定试剂中BCA形成一个在,562 nm,处具有最大光吸收的,紫色复合物,。复合物的光吸收强度与蛋白质浓度呈正比。,BCA的结构,BCA法原理示意图,第三节 免疫印迹法分析特定蛋白质的相对含量,一、,免疫印迹/Western blot的概念,二、,免疫印迹法检测样品中特异蛋白质的基本流程,三、,Western blot的常用缓冲液配置,四、,Western blot的操作步骤,五、,注意的问题,Western blot/免疫印迹：,蛋白样品经过电泳分离后，转移并固定于膜上，然后应用抗原抗体反应进行特异性检测的方法。免疫印迹法是检测蛋白质混合溶液中某种特定目的蛋白的定性方法，也可以作为确定同一种蛋白质在不同细胞或同一种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法。,Southern blot,Northern blot,一、免疫印迹/Western blot的概念,二、免疫印迹法检测样品中特异蛋白质的基本流程,样品的凝胶电泳,蛋白印迹,封闭反应,与特异性抗体（一抗）孵育,与酶耦联的二抗孵育,显色或化学发光显影,观察和记录结果,三、Western blot的常用缓冲液配置,电转移缓冲液,48 mmol/L Tris,39 mmol/L 甘氨酸,0.01%SDS,20%甲醇,TBST,20 mmol/L Tris-HCl/pH 7.5,0.15 mol/L NaCl,0.05%Tween-20,封闭液,（TBST+5%脱脂奶粉或牛血清白蛋白）,抗体稀释液,（TBST+1%脱脂奶粉或牛血清白蛋白）,四、Western blot的操作步骤,用纯化的,免疫小鼠，制备,特异性的抗血清。,制备样品，用,SDS-PAGE,电泳分离。,用（半干式）电转移法将蛋白质转至,PVDF,或,NC,膜上。,（,1,）将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡,20 min,以上。,（,2,）裁剪与凝胶大小一致的,PVDF,膜或,NC,膜。,注意,：,PVDF,膜要先用甲醇浸润,10 s,，蒸馏水漂洗,10 min,，然后在电转移缓冲液中平衡,10 min,以上。,NC,膜直接在电转移缓冲液中平衡,10 min,以上即可。,（,3,）裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、,PVDF,膜或,NC,膜、凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。,（,4,）按,0.5 mA/cm,2,膜恒流电转移,1 h,。,将膜在封闭液中室温反应,60 min,。,转移膜至,特异性的抗血清（一抗工作液）中，室温反应,45-60 min,。,用,TBST,漂洗。,3,次，每次,10 min,。,转移膜至碱性磷酸酶（,AP,）偶联的羊抗鼠,IgG,（二抗工作液）中，室温反应,45-60 min,。,用,TBST,漂洗。,3,次，每次,10 min,。,显色反应。将膜浸泡在,NBT/BCIP,显色液中，避光静置，待出现清晰条带后，把膜转移至蒸馏水中中止反应。,观测和记录结果。,VP39的Western blot分析,五、注意的问题,（一）样品的凝胶电泳,1.,PAGE,2.,SDS-PAGE,3.,Tris-Tricine胶电泳：,用于分子量小于10 kDa的多肽及蛋白质的电泳，能够获得较好的分离效果。,（二）转膜,1.,戴手套，避免用手接触滤纸、凝胶和膜，因为手上的油脂会阻断转印。,2.,滤纸和膜的尺寸与凝胶大小一致。,3.,转膜方向要正确：凝胶在阴极，膜在阳极。,4.,排除滤纸、凝胶和膜之间的气泡。,5.,电转时间可根据蛋白质分子量的大小灵活选择。,6.,电转结束后，凝胶可用考马斯亮兰染色以确定转移效率。,（三）显色或显影,1.显色,辣根过氧化物酶：底物为DAB。,碱性磷酸酶：底物为BCIP/NBT。,2.化学发光显影,最常用的辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶有不同的发光底物（商品化产品）。,曝光的时间和显影的时间根据实际情况而定。,第四节 酶联免疫吸附试验,（enzyme linked immunosorbant assay，ELISA）,一、,ELIAS的原理,二、,ELIAS的类型,三、,ELISA的步骤,四、,ELISA的常规生色底物（S）,五、,结果判断,六、,注意事项,原理：,酶联免疫吸附试验是一种,固相免疫测定技术,，先将已知的Ab或Ag包被到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标Ag或Ab按不同步骤与固相载体表面吸附的Ab或Ag发生特异性反应。最后加入酶反应底物，根据底物被酶催化产生的颜色及其光密度（OD）值的大小进行定性或定量分析。,优点：,灵敏度高；特异性好；简便；重复性好。,一、ELIAS的原理,酶标板,0601酶标仪,二、ELIAS的类型（根据检测目的和操作步骤分类）,1.,间接法,2.,双抗体夹心法,3.,竞争法,1.间接法,间接法测抗体,2.双抗体夹心法/三明治法,双抗体夹心法测抗原,只适用于大分子抗原，不能用于测定半抗原等小分子物质,3.竞争法,此法可用于抗原、半抗原和抗体的测定。,原理：,参考管,中只加入酶标Ag，不加受检样品，因而与固相抗体结合的酶标Ag最多，颜色最深。,测定管,中加入酶标Ag和受检样品。受检样品的Ag量越多，竞争性抑制酶标Ag与固相Ab的结合，使得固相上结合的酶标Ag越少，测定管颜色就越浅。根据参考管与测定管OD值之比，计算样品中待测Ag的含量。,竞争法测抗原,三、ELISA的步骤（以双抗体夹心法为例）,向微孔板内加入,抗,特异性抗体,进行包被。,4C,反应,24-36 h,或,37C,反应,2 h,。,用,PBST,洗涤。,加入封闭液进行封闭。,37C,反应,2 h,或,4C,反应过夜。,向微孔板内加入待测样品。,37C,反应,45-60 min,。,用,PBST,洗涤。,向微孔板内加入酶标记的,抗,特异性抗体,。,37C,反应,45-60 min,。,用,PBST,洗涤。,向微孔板内加入底物溶液。室温避光反应,1530 min,。,酶标仪检测。,记录和分析结果。,包被抗体一般选择单克隆抗体，,酶标记抗体一般选择多克隆抗体。,四、ELISA的常规生色底物,（S）,（一）辣根过氧化物酶（HRP）底物,ABTS,水溶性底物，在,HRP,的作用下产生绿色终产物。该绿色产物在,410 nm,及,650 nm,具有两个主要的吸收峰。,OPD,在,HRP,的作用下生成桔黄色的产物，在,492 nm,时吸收最大。,TMB,在,HRP,的作用下生成蓝色产物，主要吸收峰在,370 nm,和,652 nm,。,加入硫酸或磷酸后，它会变成黄色，最大吸收峰为,450 nm,。,TMB,灵敏度很高，达到相同的检测灵敏度需要的量比,ABTS,少，但这也可能产生较高的背景，所以要求使用较少的蛋白或较低的抗体浓度。,（二）碱性磷酸酶（AP）底物,PNPP,碱性磷酸酶,和PNPP反应后，形成黄色水溶反应产物，该产物在,405 nm,处有光吸光。,五、结果判断,1.,直接用“阳性”或“阴性”表示结果。,一般用于传染性疫病（如肝炎）的诊断。在进行大量的阳性和阴性标本测定后，定出某吸光度值为阳性和阴性的分界点。,2.,用终点“滴度”表示阳性结果。,将标本进行一系列稀释，用,阳性的最高稀释度,表示结果。,3.,光密度读数直接表示阳性的程度。,这时应用,某固定阳性标本,为参考。,4.,用“比率”表示。,以,某固定阴性标本,为参考，以标本读数为该参考阴性标本读数的倍数来表示阳性程度。,5.,标准曲线法。,以,阳性标准化标本,做一系列稀释得到标准曲线，各受检标本的读数与标准曲线相比，计算出绝对值。（标准曲线每次测定都需要重新做）,六、注意事项,1.酶标记抗体以及待检样本的使用浓度应事先滴定。,2.保存的血清切忌反复冻融，以免降低血清中抗体或抗原的免疫学活性。,3.底物液一定在临用前现配。,