第11章DNA合成BFD.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第十章,核酸的,生物学功能,DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。,生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中,。,第一节 DNA的生物合成,DNA BioSynthesis(Replication),本节主要内容,DNA的复制,半保留复制,复制起始点,复制的不连续性,复制相关的酶和蛋白质,复制过程,DNA的损伤与修复,RNA指导下的DNA合成（反向转录）,多聚酶链式反应（PCR）,遗传信息传递的中心法则,(Central dogma),蛋白质,翻译,转录,逆转录,复制,复制,DNA,RNA,生物的遗传信息以密码的形式储存在DNA分子上，表现为特定的核苷酸排列顺序。在细胞分裂的过程中，通过DNA,复制,把亲代细胞所含的遗传信息忠实地传递给两个子代细胞。在子代细胞的生长发育过程中，这些遗传信息通过,转录,传递给RNA，再由RNA通过,翻译,转变成相应的蛋白质多肽链上的氨基酸排列顺序，由蛋白质执行各种各样的生物学功能，使后代表现出与亲代相似的遗传特征。后来人们又发现，在宿主细胞中一些RNA病毒能以自己的RNA为模板,复制,出新的病毒RNA，还有一些RNA病毒能以其RNA为模板合成DNA，称为,逆转录,这是中心法则的补充。,意义：,中心法则总结了生物体内遗传信息的流动规律，揭示遗传的分子基础，不仅使人们对细胞的生长、发育、遗传、变异等生命现象有了更深刻的认识，而且以这方面的理论和技术为基础发展了基因工程，给人类的生产和生活带来了深刻的革命,。,中心法则主要内容:,（1）DNA的复制（DNA指导下的DNA合成),（2）RNA指导下RNA的合成(RNA的复制),（3）DNA指导下RNA的合成（转录）,（4）逆转录作用（RNA指导下的DNA的合成,（5）RNA通过翻译转变成相应的蛋白质,多肽链上的氨基酸排列顺序,（一）,、DNA的半保留复制,子代DNA分子中一条链来自亲代，另一条链是新合成的，这种复制方式称为,半保留复制,(semi-conservative replication)。,一、DNA的复制,复制,（,replication,）,以,DNA,为模板,在,DNA,聚合酶的催化下按碱基互补配对原则,聚合成新的,DNA,链的过程。,1、半保留复制实验依据,：1958年由M.Meselson 和 F.Stahl 所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含,15,N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为,15,N。将大肠杆菌移至只含,14,N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果：,（二）、DNA复制开始,DNA,复制开始于一个特定的位点，称为,原点(origin),。,从原点开始同时向DNA链两个方向进行，形成一个分叉，称为,复制叉(replieationfork),。,又称,复制眼(replication eye),。,环形DNA复制时由于复制眼的形成，构成了一个有内圈的闭合环状体，这种形式称为,Q结构,。,大肠杆菌全部基因组(含4X106bp)只有,一个复制原点,。高等生物体中DNA具有,多个复制原点,起始点,复制叉1,复制叉2,复制叉1,复制叉2,复制起始时复制叉移动所形成的复制眼,环状 DNA复制时所形成的Q结构,起始点,复制叉的推进,真核细胞DNA复制的特点,多个起点复制,起点,起点,起点,起点,起点,起点,由于,DNA聚合酶,只能以,53,方向聚合,子代DNA链,，即,模板DNA链,的方向必须为,35,。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的,方式就不同,。,（三）、DNA的半不连续复制,以,35,方向的亲代,DNA,链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为,53,，这一条链被称为,前导链,.,(leading strand),。,以,53,方向的亲代,DNA,链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是,53,，这条链被称为,随从链,(lagging strand),。,在前导链延长1000 2000个核苷酸后，另一母链也作为模板指导新链也是沿53合成1 000 2 000个核苷酸的小片段，这就是冈崎片段。随着链的延长，可以有许多个冈崎片段，这条称为随从链.,随从链为不连续复制，所以DNA为半不连续复制.,复制后，这些冈崎片段由DNA连接酶的作用而连接成完整的新链。,原核细胞DNA的半不连续复制复制过程,复制叉的移动方向,解旋酶,DNA聚合酶III,解链酶,引物体,DNA聚合酶I,SSB,3,3,5,前导链,随后链,3,5,复制的起始,DNA链的合成与延长,DNA链合成的终止,5,RNA引物,（四）、DNA的复制相关的酶和蛋白质,1、DNA聚合酶,指以DNA为模板，dNTP为底物催化DNA合成的一类酶。原核和真核细胞中均普遍存在。,（1）、种类,原核生物：三种,DNA聚合酶（pol）；,DNA聚合酶（pol）；,DNA聚合酶（pol）；,这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。,参与DNA复制的主要是pol 和po。,1958年A.Kornberg在大肠杆菌中发现,（2）,作用特点：,1.,需dNTP,，Mg+,DNA,模板,2.只能以,5-3方向延长链,，不能发动新链,3.需有一个游离3-OH的,引物,（3）DNA,聚合酶的活性,5,至,3,的聚合活性,5 3,方向,核酸 外切酶活性,5 3,外切酶活性,3 5,外切酶活性,DNA聚合反应有关的酶类,DNA聚合酶(，),1.,DNA聚合酶,:,具有多种催化功能,。,5-3 聚合酶作用,3-5 核酸外切酶作用(校读功能,保证DNA复制的真实性),5-3 核酸外切酶作用(切除引物,并填补切除引物留下的裂隙),DNA聚合酶的3,-5,外切酶水解位点,3,3,5,5,错配碱基,3,-,5,核酸外切酶水解位点,DNA聚合酶,5-3 聚合酶作用,3-5 核酸外切酶作用,参与DNA的损伤和修复作用,DNA聚合酶,5-3 聚合酶作用,3-5 核酸外切酶作用,5-3 核酸外切酶作用,半保留复制的主要酶,合成DNA,原核生物中的三种DNA聚合酶,DNA聚合酶的校对功能,聚合酶,错配硷基,复制方向,正 确核苷酸,5,5,5,3,3,3,切除错配核苷酸,参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3端自由羟基（3-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。,DNA聚合酶都需要一个具3-OH的引物，才能将合成原料dNTP一个一个接上去。因为DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP在DNA模板上进行聚合,RNA引物酶却具有此能力,.,引物的大小,：,原核生物：50100个核苷酸；,真核生物中约为10个核苷酸。,引物酶,本质,上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3-OH，使子代DNA链能够开始聚合。,2、引物酶,3、解螺旋酶(rep蛋白),解螺旋酶(unwinding enzyme），又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现至少存在两种解螺旋酶。,4、单链结合蛋白,单链DNA结合蛋白（single strand binding protein,SSB）又称螺旋降稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。,作用,：使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；,保护单链DNA，避免核酸酶的降解。,5、拓扑异构酶(topoisomerase),拓扑异构酶,可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。,拓扑异构酶,可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后,再将其连接起来。,作用：,产生负超螺旋和消除超螺旋。,大肠杆菌拓朴异构酶的结构,6、DNA连接酶,（基因工程重要的工具酶）,作用：,在DNA修复、重组、剪接中缝合缺口,但：,不连接单独存在的DNA或RNA单链,DNA连接酶催化的条件：,需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基；,未封闭的缺口位于双链DNA中,，即其中有一条链是完整的；,需要消耗能量，在,原核生物中由NAD,+,供能,，在,真核生物中由ATP供能,。,（五）DNA生物合成过程,1、复制的起始,DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。,（1）预引发：,识别起点，,解旋解链，形成复制叉：,参与蛋白及酶：,拓扑异构酶；,解链酶,单链DNA结合蛋白（SSB）,原核生物E.coli为例,（2）引发：,在,引物酶,的催化下，以,DNA,为模板，合成一段短的,RNA,片段，从而获得,3,端自由羟基（,3-OH,）。,复制由起始点 oriC(origin)开始双向复制,E.coli的复制起始点oriC（245bp的DNA组分）,序列分析有如下特点,3组重复序列(13bp），每个顺序都由,GATC,开始,2组反向重复序列(9bp),4个,dnaA,蛋白结合部位,当,dnaA,蛋白结合在此时，复制就开始。,dnaA,使,dnaB,和,dnaC,等蛋白复合物进入,DNA,的熔解区形成,前引物化复合物,，于是导致模板,DNA,双螺旋解链。同时活化引物酶,2、复制的延长,连续复制:,leading strand,不连续复制,:,lagging strand,冈崎片段（Okazaki fragment）,不连续复制的不连续片段,复制叉处前导链和随后链同时合成的工作模型,聚合酶III全酶,引物,聚合酶III全酶,引物,引物体,引物体,解旋酶,解旋酶,DNA聚合酶全酶,的对称二聚体使两条链在全酶上同时同方向合成。,3、复制的终止,包括,切除引物：,由DNA聚合酶I催化,填补空隙：,由DNA聚合酶I催化,连接缺口：,由DNA连接酶催化,新合成的两条染色体DNA分子相互连在一起，被拓扑异构酶IV分离,原核细胞DNA的半不连续复制复制过程,复制叉的移动方向,解旋酶,DNA聚合酶III,解链酶,引物体,DNA聚合酶I,SSB,3,3,5,前导链,随后链,3,5,复制的起始,DNA链的合成与延长,DNA链合成的终止,5,RNA引物,DNA的生物合成,-,复制的过程小结,双链DNA的复制包括,识别起点、解链解旋、,合成引物 延长子链,切除引物、填补连接,（六）、复制的忠实性,DNA复制过程是一个高度精确的过程，据估计，大肠杆菌DNA复制10,9,-10,10,碱基对仅出现一个误差，保证复制忠实性的原因主要有以下三点:,DNA聚合酶的校对功能（错配碱基被3-5,外切酶切除）,起始时以RNA作为引物,DNA聚合酶的高度专一性（严格遵循 碱基配对原则）,聚合时的方向为5-3,细胞的各种修复机制。,真核生物DNA的复制,拓扑异构酶,DNA聚合酶,复制蛋白A(类似SSB),复制因子C(控制滞后链上酶的结合与脱离),端粒酶：,端粒酶,的发现获得,诺贝尔生理学或医学奖。端粒酶衰老和癌症的潜在关系,。,三、,DNA,的突变,DNA,分子中的核苷酸序列发生突然而稳定的改变，从而导致DNA的复制以及后来的转录和翻译产物随之发生变化，表现出异常的遗传特性，称为DNA的突变。它包括由于DNA损伤和错配得不到修复而引起的突变，以及由于不同DNA分子之间的交换而引起的遗传重组。,二、,诱变剂的作用,碱基类似物,(,base analog),碱基修饰剂,(,base modifier),嵌入染料,(,intercalation dye),紫外线,(,ultraviolet),和电离辐射,(,ionizing radiation),一、,突变的类型,碱基对的置换,(substitution),移码突变,(framesshift mutation),DNA突变的类型,-T-C-G-G-C-T-G-T-A-C-G-,-A-G-C-C-G-A-C-A-T-G-C-,转换,-T-C-G-A-,G,-C-T-G-T-A-C-G-,-A-G-C-T-,C,-G-A-C-A-T-G-C-,插入,A,-T-C-G-C-T-G-T-A-C-G-,-A-G-C-G-A-C-A-T-G-C-,缺失,T,野生型基因,-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G-,-A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-,-T-C-G-T-C-T-G-T-A-C-G-,-A-G-C-A-G-A-C-A-T-G-C-,颠换,碱基对的置换(substitution),移码突变,(framesshift mutation),四、DNA的损伤与修复,某些物理化学因子，如紫外线、电离辐射和化学诱变剂等，都有引起生物突变和致死的作用，其机理是作用于DNA，造成DNA结构和功能的破坏，称为DNA的损伤.,DNA的修复主要有以下类型:,暗修复,（4）,诱导修复,（SOS修复）,（1）,光裂合酶修复活,（2）,切除修复,（3）,重组修复,1、光修复：,光修复酶催化,胸腺嘧啶二聚体,紫外光照射可使相邻的两个,T,形成二聚体,可见光（最有效波长,400nm,）,激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。,是一种,高度专一,的修复形式，只分解由于,UV,照射而形成的嘧啶二聚体。,DNA紫外线损伤的光裂合酶修复,2、切除修复,（excission repairing）,：一种多酶的催化过程，4个步骤,(1)由,特异内切核酸酶,识别,损伤，并在损伤前的糖磷酸骨架上切开一个裂口。裂口处有3-OH和含有损伤区的5端。（切）,(2),DNA聚合酶,以3-OH为引物，以另一条完好的互补链为模板进行修复，合成一段新片段（补）,(3)损伤区被,DNA聚合酶,的5-3外切酶活性作用切除。（切）,(4)新合成的DNA片段和原存在的DNA部分由,连接酶,催化相连。（封）,（复制前修复）,3、重组修复,（recombination repairing）,这种修复中含嘧啶二聚体的DNA片段仍可进行复制，但子链中在损伤的对应部位出现缺口。复制后通过,分子内重组,或称为,姐妹链交换,(sisterstmnd exchanSe)，从完整的亲代链上把相应碱基顺序的片段移至子代链缺口处，使之成为完整的分子。亲链上的缺口由,聚合酶I,和,连接酶,填补完整，这就称为,重组修复。,（复制后修复）,3SOS修复：,这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以SOS借喻细胞处于危急状态。,DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。,损伤,诱导,一种,特异性较低,的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。,由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。,SOS反应机制,结局,不能存活,继续存活,表型不理想,表型理想,进化动力,三、RNA指导下的DNA合成（反向转录）,1、概念,2、逆转录酶,三种功能,依赖DNA指导下的DNA聚合酶活力,依赖RNA的DNA聚合酶活力,核糖核酸酶H活力,以RNA为模板合成DNA，这与通常转录过程中遗传信息从DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录作用。,依赖RNA的DNA聚合酶,核糖核酸酶H活力,依赖DNA的DNA聚合酶,3、,病毒逆转录过程,4,、,逆转录的生物学意义,扩充了中心法则,有助于对病毒致癌机制的了解,与真核细胞分裂和胚胎发育有关,逆转录酶是分子生物学重要工具酶,四、多聚酶链式反应,（PCR）,多聚酶链式反应（Polymerases chain Reaction)是20世纪80年代末发展起来的一种快速的DNA特定片段体外合成扩增的方法。,PCR是由美国科学家,穆利斯提出的一种,体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA,快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝,尔化学奖。,优点：它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等。,PCR技术基本原理,PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。,PCR由,变性-退火-延伸,三个基本反应步骤构成：,模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；,引物的延伸：DNA模板-引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链.重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。,每完成一个循环需 24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,PCR技术,原理示意图,靶序列,变性和引物复性,循环1,循环2,循环3,变性和引物复,性,链延伸,Taq酶,链延伸,PCR反应五要素：,参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg,2+,引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。,设计引物应遵循以下原则：,引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。,引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。,引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。,避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补。,引物3端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。,引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。,聚合酶,酶及其浓度 目前有两种,Taq DNA,聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。,DNA聚合酶的问题？,常温酶不耐热,耐热DNA聚合酶的分离：,1988年Cetus 公司从美国黄石国家公园的温泉中分离到一株耐热的水生细菌YT-1（Thermus aquaticus strain YT-1），其DNA聚合酶耐热，命名为Taq 酶。,dNTP的质量与浓度,dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200 umol/L，浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与,Mg,2+,结合，使游离的,Mg,2+,浓度降低。,模板(靶基因)核酸,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。,SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。,Mg,2+,浓度,Mg,2+,对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，,Mg,2+,浓度为1.52.0mmol/L为宜。,Mg,2+,浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。,PCR反应条件的选择,PCR反应条件为,温度、时间和循环次数,。,温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。,在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。,变性温度与时间：,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板DNA变性，若低于93则 需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。,退火(复性)温度与时间：,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。,退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长 度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。,延伸温度与时间,：,PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。34kb的靶序列需34min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。,循环次数,循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,PCR扩增产物分析,PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。,凝胶电泳分析,：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小，这是起码条件。,琼脂糖凝胶电泳,：通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。,聚丙烯酰胺凝胶电泳：,610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。,酶切分析,：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。,分子杂交,：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。,Southern,印迹杂交,：在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针,PCR的特点,1、对DNA模板要求不高，纯度也不严，用量很低；,2、引物设计十分重要，它决定了PCR扩增片段的大小及特异性，,3、碱基配对原则；,4、需要一个耐热的DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性。,PCR技术已成为 分子生物学、医学、生物工程、法医学及考古学等领域不可缺少的工具。,PCR的步骤,90-95 变性5min，然后9530sec、55-6530sec、,7230sec，共30-45个循环，最后72再延伸5min。,