新版生物化学蛋白质.pptx

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,、,掌握基本氨基酸结构、分类、性质以及肽概念特点，分离纯化基本方法。,2,、重点掌握蛋白质结构、性质以及结构和功效相互关系，蛋白质分离纯化方法、技术。,本章学习重点,新版生物化学蛋白质,第1页,第一节 蛋白质元素组成、分类及生物学功效,一、蛋白质元素组成,二、蛋白质分类,三、蛋白质生物学功效,新版生物化学蛋白质,第2页,一、蛋白质元素组成,蛋白质是一类含氮有机化合物,，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少许硫。一些蛋白质还含有其它一些元素，主要是磷、铁、碘、钼、锌和铜等。这些元素在蛋白质中组成百分比约为：,碳,50,氢,7,氧,23,氮,16%,硫,0,3,其它 微 量,新版生物化学蛋白质,第3页,蛋白质含氮量,蛋白质平均含氮量为,16%,，这是蛋白质元素组成一个特点，也是,凯氏（,Kjedahl,）定氮法,测定蛋白质含量计算基础。所以，能够依据生物样品中含氮量来计算蛋白质大约含量：,蛋白质含量,=,蛋白氮,6.25,6.25,为,蛋白质系数,，即,1,克氮所代表蛋白质量（克数）,新版生物化学蛋白质,第4页,三聚氰胺粉末,不溶于冷水，溶于热水，微溶于乙二醇、甘油、乙醇，不溶于乙醚、苯、四氯化碳,遇强酸或强碱水溶液水解。,三聚氰胺含氮量高达,66.6%,其实凯氏定氮法缺点并不难填补，只要多一道步骤即可：先用三氯乙酸处理样品。三氯乙酸能让蛋白质形成沉淀，过滤后，分别测定沉淀和滤液中氮含量，就能够知道蛋白质真正含量和冒充蛋白质氮含量。,新版生物化学蛋白质,第5页,蛋白质分子组成,经酸、碱和酶处理蛋白质,，使其彻底水解得到产物为氨基酸，组成蛋白质常见,20,种氨基酸中除,脯氨酸,外，均为,-,氨基酸：,不变部分,可变部分,新版生物化学蛋白质,第6页,二、蛋白质分类,1,、据分子形状分,2,、据分子组成份,3,、据溶解度分,4,、据生物功效分,球状蛋白质（,globular protein,）,*纤维状蛋白质（,fibrous protein,）,新版生物化学蛋白质,第7页,外形靠近球形或椭圆形，溶解性很好，细胞中大多数可溶性蛋白质如胞质酶类，属于这类。,球状蛋白质（,globular protein,）：,新版生物化学蛋白质,第8页,分子类似纤维或细棒。,大都是结构蛋白，如胶原蛋白，角蛋白等。,可分为可溶性纤维状蛋白质（如,肌肉中肌球蛋白）,和不溶性纤维状蛋白质（,如胶原蛋白，角蛋白等）,。,*,纤维状蛋白质（,fibrous protein,）：,新版生物化学蛋白质,第9页,简单蛋白,(simple protein),结合蛋白,(conjugated protein),1,、据分子形状分,2,、据分子组成份,3,、据溶解度分,4,、据生物功效分,新版生物化学蛋白质,第10页,简单蛋白,又称为单纯蛋白质；这类蛋白质仅由氨基酸组成，不含其它化学成份。,*清蛋白和球蛋白：,albumin and globulin,广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。,*谷蛋白,(,glutelin,),和醇溶谷蛋白,(,prolamin,),：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于,70,80,乙醇中。,*精蛋白和组蛋白,：碱性蛋白质，存在与细胞核中。,*硬蛋白,：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。,新版生物化学蛋白质,第11页,结合蛋白,除氨基酸外，还含有其它化学成份（辅因子），如：,*色蛋白：含色素物质，如血红蛋白、细胞色素等。,*糖蛋白：含糖类物质，如细胞膜中糖蛋白等。,*脂蛋白：含脂类。，如血清,-,，,-,脂蛋白等。,*核蛋白：含核酸结合而成，如核糖体。,新版生物化学蛋白质,第12页,1,、据分子形状分,2,、据分子组成份,3,、据溶解度分,4,、据生物功效分,清蛋白、球蛋白、,谷蛋白、醇溶蛋白等,新版生物化学蛋白质,第13页,依据溶解度：,清蛋白：又称白蛋白。溶于水。如乳清蛋白、血清清蛋白,球蛋白：微溶于水，溶于稀中性盐溶液。如大豆球蛋白,谷蛋白：不溶于水、醇及中性盐溶液。但溶于稀酸、稀碱。如米、麦蛋白,醇溶蛋白：不溶于水、溶于,70-80%,乙醇。如玉米蛋白,另外还有精蛋白、组蛋白、硬蛋白等,新版生物化学蛋白质,第14页,酶、结构蛋白、运输蛋白、营养和储存蛋白、收缩蛋白和运动蛋白、防御蛋白、调整蛋白,1,、据分子形状分,2,、据分子组成份,3,、据溶解度分,4,、据生物功效分,新版生物化学蛋白质,第15页,三、蛋白质生物学功效,1,、催化功效,酶类,2,、结构功效,（胶原蛋白；韧带中弹性蛋白；头发、指甲,和皮肤中不溶性角蛋白；蚕丝、蛛网）,3,、营养和储存功效,（,卵清蛋白和牛奶中酪蛋白,）,4,、运输功效,（,血红蛋白、肌红蛋白,）,5,、收缩或运动功效,（骨骼肌收缩,肌动蛋白和肌球蛋白相对滑动结果）,6,、激素功效,（,胰岛素,）,7,、保护和防御功效,（蛋白质抗体和免疫球蛋白）,8,、接收和传递信息功效,（受体蛋白,）,9,、调整或控制细胞生长、分化和遗传信息表示功效,（组蛋白、阻遏蛋白）,蛋白质是生命活动物质基础，它参加了几乎全部生命活动过程。,新版生物化学蛋白质,第16页,小结,第一节 蛋白质元素组成、分类及生物学功效,一、蛋白质元素组成,二、蛋白质分类,三、蛋白质生物学功效,新版生物化学蛋白质,第17页,第二节 氨 基 酸（,amino acid,）,一、氨基酸分类,二、氨基酸理化性质,三、氨基酸分离分析,新版生物化学蛋白质,第18页,蛋白质水解,依据水解程度,完全水解 氨基酸混合物,不完全水解 大小不等肽和氨基酸,依据水解方法,酸水解：多数氨基酸稳定，不引发消旋作用；,Trp,完全被破坏，羟基氨基酸部分分解，,Gln,和,Asn,酰胺基被水解下来。,碱水解：,Trp,稳定；多数氨基酸被不一样程度破坏，且产生消旋现象，,Arg,脱氨。,酶水解：不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，但需各种酶协同作用。,新版生物化学蛋白质,第19页,水解方法,反应条件,产物,优点,缺点,酸水解,6M HCl,或,4M H,2,SO,4,共煮,20hrs,L-aa,不引发消旋,Trp被破坏；一部分羟基aa(Ser,Thr)被分解；Asn 和Gln 酰胺基被水解下来,碱水解,5M NaOH,共煮,20hrs,L-aa,和,D-aa,混合物,不破坏,Trp,引发消旋；,Arg 脱氨基生成鸟氨酸,酶水解,生理温度、,pH,肽段和氨基酸混合物,不破坏aa,不引发消旋,酶解时间长,新版生物化学蛋白质,第20页,蛋白质氨基酸组成,当前已发觉氨基酸有,250,各种。不过组成蛋白质常见氨基酸只有,20,种，称为,基本氨基酸,。,各种蛋白质所含,20,种常见氨基酸种类和数目各不相同。或者说，,20,种常见氨基酸不一样排列次序组成了特定蛋白质。,蛋白质分子中氨基酸组成与其性质相关。另外蛋白质分子中氨基酸组成及百分比与其结构也有一定关系。,新版生物化学蛋白质,第21页,一、氨基酸分类,依据是否组成蛋白质分为：,1.,蛋白质中常见氨基酸,2.,蛋白质中稀有氨基酸,3.,非蛋白氨基酸,依据,R,侧链极性分类,依据,R,侧链结构分类,从营养学角度分类,新版生物化学蛋白质,第22页,1.,常见蛋白质氨基酸（,20,种）,有对应遗传密码。,近年发觉谷胱甘肽过氧化物酶中存在硒代半胱氨酸，有证据表明此氨基酸由终止密码,UGA,编码，可能是第,21,种蛋白质氨基酸。,新版生物化学蛋白质,第23页,结构通式（脯氨酸除外）,共同特点：,L-,型，羧基相连,-,碳上连接,-NH,2,，所以都是,L-,氨基酸。,不变部分,可变部分,新版生物化学蛋白质,第24页,依据,R,基团极性,20,种常见氨基酸又分为,(1),非极性,R,基团氨基酸：,8,种,Ala Val Leu Ile Phe Pro Trp Met,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸：,7,种,Gly Ser Thr Tyr Asn Gln Cys,(3),带负电荷,R,基团氨基酸：,2,种,Asp Glu,(4),带正电荷,R,基团氨基酸：,3,种,Lys Arg His,1,、蛋白质中常见氨基酸结构,新版生物化学蛋白质,第25页,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,氨基丙酸,丙氨酸,Ala,nine,新版生物化学蛋白质,第26页,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,氨基异戊酸,丙氨酸,Ala,nine,缬氨酸,Val,ine,新版生物化学蛋白质,第27页,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,氨基异己酸,丙氨酸,Ala,nine,缬氨酸,Val,ine,亮氨酸,Leu,cine,新版生物化学蛋白质,第28页,-,氨基,-,-,甲基戊酸,丙氨酸,Ala,nine,缬氨酸,Val,ine,亮氨酸,Leu,cine,异亮氨酸,Ile,ucine,(1),非极性,R,基团氨基酸,新版生物化学蛋白质,第29页,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,苯基丙,酸,丙氨酸,Ala,nine,缬氨酸,Val,ine,亮氨酸,Leu,cine,异亮氨酸,Ile,ucine,苯丙氨酸,Phe,nylalanine,新版生物化学蛋白质,第30页,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,吡咯烷基,-,-,羧酸,丙氨酸,Ala,nine,缬氨酸,Val,ine,亮氨酸,Leu,cine,异亮氨酸,Ile,ucine,苯丙氨酸,Phe,nylalanine,脯氨酸,Pro,line,新版生物化学蛋白质,第31页,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,吲哚基丙,酸,丙氨酸,Ala,nine,缬氨酸,Val,ine,亮氨酸,Leu,cine,异亮氨酸,Ile,ucine,苯丙氨酸,Phe,nylalanine,脯氨酸,Pro,line,色氨酸,Tr,y,p,tophan,新版生物化学蛋白质,第32页,(1),非极性,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,甲硫基丁酸,丙氨酸,A,la,nine,缬氨酸,V,al,ine,亮氨酸,L,eu,cine,异亮氨酸,I,le,ucine,苯丙氨酸,Phe,nylalanine(,F,),脯氨酸,P,ro,line,色氨酸,Tr,y,p,tophan(,W,),甲硫氨酸,M,et,hionine,新版生物化学蛋白质,第33页,R,基疏水性大小,Ala,Met,Pro,Val,Leu,Ile,Phe,Trp,这类氨基酸,R,基疏水性在维持蛋白质三维结构中起着主要作用。,特点：不易溶于水,新版生物化学蛋白质,第34页,Pro,是唯一一个,-,亚氨基酸，它在蛋白质空间结构中含有极主要作用，普通出现在两段,-,螺旋之间拐角处。,新版生物化学蛋白质,第35页,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,氨基乙酸,甘氨酸,Gly,cine,新版生物化学蛋白质,第36页,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,羟基丙,酸,甘氨酸,Gly,cine,丝氨酸,Ser,ine,新版生物化学蛋白质,第37页,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,羟基丁,酸,甘氨酸,Gly,cine,丝氨酸,Ser,ine,苏氨酸,Thr,eonine,新版生物化学蛋白质,第38页,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,对羟苯基丙,酸,甘氨酸,Gly,cine,丝氨酸,Ser,ine,苏氨酸,Thr,eonine,酪氨酸,Tyr,osine,新版生物化学蛋白质,第39页,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,甘氨酸,Gly,cine,丝氨酸,Ser,ine,苏氨酸,Thr,eonine,酪氨酸,Tyr,osine,天冬酰胺,As,paragi,n,e,新版生物化学蛋白质,第40页,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,甘氨酸,Gly,cine,丝氨酸,Ser,ine,苏氨酸,Thr,eonine,酪氨酸,Tyr,osine,天冬酰胺,As,paragi,n,e,谷氨酰胺,Gl,utami,n,e,新版生物化学蛋白质,第41页,(2),极性不带电荷,R,基团氨基酸,甘氨酸,G,ly,cine,丝氨酸,S,er,ine,苏氨酸,T,hr,eonine,酪氨酸,T,y,r,osine,天冬酰胺,As,paragi,n,e,谷氨酰胺,Gl,utami,n,e(,Q,),半胱氨酸,C,ys,teine,-,氨基,-,-,巯基丙,酸,特点：这类氨基酸侧链含极性基团，但在生理条件下不解离，易溶于水，,R,侧链能与水形成氢键。,新版生物化学蛋白质,第42页,Cys,中,R,含巯基（,-SH,），两个,Cys,巯基,氧化生成二硫键，生成胱氨酸。,二硫键在蛋白质结构中含有主要意义。,新版生物化学蛋白质,第43页,(3),带负电荷,R,基团氨基酸,-,氨基丁二酸,天冬氨酸,Asp,artate,新版生物化学蛋白质,第44页,(3),带负电荷,R,基团氨基酸,-,氨基戊二酸,天冬氨酸,Asp,artate(,D,),谷氨酸,Glu,tamate(,E,),在生理条件下,侧链,羧基,完全解离，带负电荷。,为酸性氨基酸。,新版生物化学蛋白质,第45页,(4),带正电荷,R,基团氨基酸,，,-,二氨基己酸,赖氨酸,Lys,ine,新版生物化学蛋白质,第46页,(4),带正电荷,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,胍基戊,酸,赖氨酸,Lys,ine,精氨酸,Arg,inine,新版生物化学蛋白质,第47页,(4),带正电荷,R,基团氨基酸,-,氨基,-,-,咪唑基丙,酸,赖氨酸,Lys,ine(,K,),精氨酸,A,r,g,inine,组氨酸,H,is,tidine,在生理条件下，侧链解离，带正电荷。,为碱性氨基酸。,新版生物化学蛋白质,第48页,另外，依据,R,侧链化学结构，,20,种常见氨基酸 能够分为：,脂肪族氨基酸（,15,种）,芳香族氨基酸（,Phe,Tyr,）,杂环族氨基酸 （,Trp,His,Pro,）,新版生物化学蛋白质,第49页,从营养学角度分类：必需氨基酸和非必需氨基酸,必需氨基酸：,人和哺乳动物不可缺乏但又不能本身合成氨基酸，只能从食物中补充,。,包含,8,种,（,Ile,、,Met,、,Val,、,Leu,、,Trp,、,Phe,、,Thr,、,Lys,）,“,一家写两三本书来,”,还有,2,种：,Arg,、,His,，人和哺乳动物即使能够合成，但数量远远达不到机体需求，尤其是在胚胎发育以及婴幼儿期间，基本上也是由食物中补充，称为,半必需氨基酸。,注：植物和微生物能合成自己全部氨基酸。,新版生物化学蛋白质,第50页,2.,蛋白质中几个主要稀有氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见氨基酸，通常称为,稀有蛋白质氨基酸。,这些氨基酸都是由对应基本氨基酸衍生而来。在,遗传上，不含有遗传密码。,其中主要有,4-,羟基脯氨酸、,5-,羟基赖氨酸、,N-,甲基赖氨酸、和,3,5-,二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸结构以下。,新版生物化学蛋白质,第51页,3.,非蛋白氨基酸（,200,各种）,广泛存在于各种细胞和组织中，呈游离或结合态，但并不存在于蛋白质中一类氨基酸，大部分也是蛋白质氨基酸衍生物。,H,2,N-CH,2,-CH,2,-COOH H,2,N-CH,2,-CH,2,-CH,2,-COOH,-,丙氨酸,-,氨基丁酸,新版生物化学蛋白质,第52页,非蛋白氨基酸存在意义,：,(1),作为细菌细胞壁中肽聚糖组分：,D-Glu D-Ala,(2),作为一些主要代谢物前体或中间体,:,-,丙氨酸、鸟氨酸（,Orn,）、胍氨酸（,Cit,）,(3),作为神经传导化学物质：,-,氨基丁酸,(4),有些氨基酸只作为一个,N,素转运和贮藏载体,(5),杀虫防御作用,:,如种子中高浓度刀豆氨酸和,5-,羟色氨酸能预防毛虫危害，高精氨酸能抑制细菌生长。,绝大部分非蛋白氨基酸功效不清楚。,新版生物化学蛋白质,第53页,1.,高熔点,2.,普通均溶于水，溶于强酸、强碱；不溶于乙醚。,3.,氨基酸普通有味：,如大米香味（,Cys),、啤酒苦味（,Val,、,Leu,、,Ile,）,氨基酸两个主要性质：,氨基酸晶体熔点高（,200,C,）；氨基酸使水介电常数增高。,二、氨基酸理化性质,（一）氨基酸普通物理性质,新版生物化学蛋白质,第54页,新版生物化学蛋白质,第55页,二、氨基酸理化性质,除甘氨酸外，其它氨基酸含有一个手性,-,碳原子，所以都含有旋光性,。,（二）氨基酸光学性质,1.,氨基酸旋光性,新版生物化学蛋白质,第56页,旋光性：,旋光物质使平面偏振光偏振面发生旋转能力。使偏振面向右旋，称右旋光物质，记为,“,+,”,，使偏振面向左旋，称左旋光物质，记为,“,-,”,。,氨基酸旋光性是由它们结构决定。,除甘氨酸外，其它氨基酸,-C,原子都与四个不一样原子和基团连接，因而是不对称,C,原子。,手性中心,（,chiral center,）：当一个,C,原子有四个不一样取代基同它连接形成一个不对称碳原子时，这个碳原子就是一个不对称中心或称做手性中心。,新版生物化学蛋白质,第57页,2.,氨基酸光吸收,组成蛋白质,20,种氨基酸在可见光区都没有光吸收,，,但在远紫外区,(97%,以上）；,b,、测定蛋白质分子质量。,（用于估算氨基酸残基数从而预计序列测定工作量大小）,测定蛋白质一级结构前要求,分子质量测定要求并不高，当前用物理化学方法测出分子质量，误差在,10%,左右就足够了。,惯用测定方法有：,凝胶过滤法；,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳法；,沉降分析法等,新版生物化学蛋白质,第121页,1,、凝胶过滤法,原理：,依据蛋白质分子量大小分离，在一定范围内蛋白质,分子量对数和洗脱体积之间成线性关系,。,V,e,/V,o,分子量对数,新版生物化学蛋白质,第122页,新版生物化学蛋白质,第123页,SDS-PAGE,法测定分子量,1),支持介质,聚丙烯酰胺,(PAGE),丙烯酰胺,为单体，,N,，,N,亚甲基双丙烯酰胺作为交联剂聚合而成具,网状结构凝胶；,新版生物化学蛋白质,第124页,在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量十二烷基硫酸钠（,SDS,），使蛋白样品与,SDS,结合形成带,负电荷复合物,，因为复合物,分子量不一样,，在电泳中反应出,不一样迁移率,。,依据,标准样品,在该系统电泳中所作出,标准曲线,，推算出被测蛋白样品分子量,近似值,。,新版生物化学蛋白质,第125页,新版生物化学蛋白质,第126页,新版生物化学蛋白质,第127页,相对迁移率,m,R,=,样品迁移距离（,cm,）,/,染料迁移距离（,cm,）,点样孔,染料迁移距离,样品迁移距离,新版生物化学蛋白质,第128页,Mr,=,bm,R,+K,Mr,为蛋白质分子量,m,R,为相对迁移率,b,为斜率,K,为截距。,新版生物化学蛋白质,第129页,沉降速度法,新版生物化学蛋白质,第130页,一级结构测定步骤,（,1,）,测定蛋白质分子中多肽链数目（,2,）拆分蛋白质分子中多肽链,（,3,）断裂多肽链内二硫键（,4,）,测定多肽链氨基酸组成（,5,）,分析多肽链,N,末端和,C,末端,（,6,）多肽链部分裂解成肽段,（,7,）测定各个肽段氨基酸次序（,8,）确定肽段在多肽链中次序（,9,）确定多肽链中二硫键位置,新版生物化学蛋白质,第131页,一级结构测定步骤,依据,N,末端或,C,末端残基摩尔数和蛋白质摩尔数（依据分子质量计算）确定,（,1,）,测定蛋白质分子中多肽链数目,（,2,）拆分蛋白质分子中多肽链,（,3,）断裂多肽链内二硫键（,4,）,测定多肽链氨基酸组成（,5,）,分析多肽链,N,末端和,C,末端,（,6,）多肽链部分裂解成肽段,（,7,）测定各个肽段氨基酸次序（,8,）确定肽段在多肽链中次序（,9,）确定多肽链中二硫键位置,新版生物化学蛋白质,第132页,（,2,）拆分蛋白质分子中多肽链,测定步骤,s,s,HCOOOH,SO,3,H,SO,3,H,多肽链之间有两种结合方式：,非共价键结合：,8mol/L,尿素或6,mol/L,盐酸胍,二硫键结合,:a.,过甲酸氧化,b.,巯基乙醇还原：可在,8mol/L,尿素或6,mol/L,盐酸胍存在下，,用过量,-,巯基乙醇处理,使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（,ICH,2,COOH,）保护生成巯基，以预防它重新被氧化。,（,3,）断裂多肽链内二硫键,新版生物化学蛋白质,第133页,胰岛素,-,巯基乙醇,碘乙酸,新版生物化学蛋白质,第134页,（,4,）测定多肽链氨基酸组成,测定步骤,完全水解，测定每种氨基酸含量，依据蛋白质分子质量，能够算出蛋白质氨基酸组成（每摩尔蛋白质中含氨基酸残基摩尔数）,方便选择用何种方法裂解蛋白质。,酸水解：,6 mol/L,盐酸或,4 mol/L,硫酸在,105-110,条件下进行水解，反应时间约,10,24,小时。缺点是,Trp,被沸酸完全破坏；含有羟基氨基酸如,Ser,、,Thr,、,Tyr,有一小部分被分解；,Asn,、,Gln,侧链酰胺基被水解成了羧基。,碱水解：用,5 mol/L,氢氧化钠煮沸,20,小时。该法优点是色氨酸,(Trp),在水解中不受破坏。,酶解：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶。,新版生物化学蛋白质,第135页,（,5,）分析多肽链,N,末端和,C,末端,测定步骤,N-,末端,残基,:,2,4-,二硝基氟苯法,丹磺酰氯法,苯异硫氰酸酯法,氨肽酶法,C,-,末端,残基：,肼解法,羧肽酶法,新版生物化学蛋白质,第136页,1,、,N,端分析（氨基末端分析）,二硝基氟苯（,FDNB,）法,FDNB,新版生物化学蛋白质,第137页,Edman,降解法（苯异硫氰酸酯法）,新版生物化学蛋白质,第138页,新版生物化学蛋白质,第139页,丹磺酰氯（,DNS-Cl,）法,乙酸乙酯抽提,色谱判定,新版生物化学蛋白质,第140页,氨肽酶法,氨肽酶是一个肽链,外切酶,，它能从多肽链,N-,端,逐一向里水解。,依据,不一样反应时间测出酶水解所释放出,AA,种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道,Pr N-,末端残基次序。,最常,用为,亮氨酸氨肽酶,，水解以亮氨酸残基为,N-,末端肽键速度最大。,新版生物化学蛋白质,第141页,NH,2,Phe,Glu,Leu.,氨肽酶法测定,N,端氨基酸,新版生物化学蛋白质,第142页,2,、,C-,末端分析（羧基末端分析）,肼解法,苯甲醛,不溶于水,DNFB,DNFB-AA,色谱分析判定,水相,新版生物化学蛋白质,第143页,羧肽酶法,NH,2,Phe,Glu,Leu.,COOH,Phe,Glu,Leu.,Leu,Glu,Phe,COOH,新版生物化学蛋白质,第144页,羧肽酶种类：,羧肽酶,A,羧肽酶,B,Leu,Pro,Lys(Arg or Pro),COOH,不能切割,不能切割,Leu,Pro,Lys(Arg),COOH,能切割,新版生物化学蛋白质,第145页,小结,:,蛋白质末端分析（,N,、,C,端）,N,末端分析,二硝基氟苯（,FDNB,）法,Edman,降解法,丹磺酰氯（,DNS-Cl,）法,氨肽酶法,C,末端分析,肼解法,羧肽酶,新版生物化学蛋白质,第146页,测定步骤,（,6,）,多肽链断裂成多个肽段,可采取两种或各种不一样断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,A1 A2 A3 A4,B1 B2 B3,新版生物化学蛋白质,第147页,酶解法,:,胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶,多肽链选择性降解,化学法：,溴化氰，羟胺,新版生物化学蛋白质,第148页,T,rypsinase,：,R,1,=Lys,和,Arg,侧链（专一性较强，水解速度快）。,R,2,=Pro,水解受抑。,肽链,水解位点,胰蛋白酶,新版生物化学蛋白质,第149页,或胰凝乳蛋白酶,（,C,hymotrypsin,）：,R1=Phe,Trp,Tyr;Leu,，,Met,和,His,水解稍慢。,R,2,=Pro,水解受抑。,肽链,水解位点,糜蛋白酶,新版生物化学蛋白质,第150页,P,epsin,：,R,1,和,R,2,Phe,Trp,Tyr;Leu,以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。,R,1,=Pro,水解受抑。,肽链,水解位点,胃蛋白酶,新版生物化学蛋白质,第151页,thermolysin,：,R,2,=Phe,Trp,Tyr;Leu,，,Ile,Met,以及其它疏水性强氨基酸水解速度较快。,R,2,=Pro,或,Gly,水解受抑。,肽链,水解位点,嗜热菌蛋白酶,新版生物化学蛋白质,第152页,分别从肽链羧基端和氨基端水解,肽链,水解位点,羧肽酶和氨肽酶,新版生物化学蛋白质,第153页,谷氨酸蛋白酶：,R,1,=Glu,、,Asp(,磷酸缓冲液,),R,1,=Glu(,磷酸缓冲液或醋酸缓冲液,),精氨酸蛋白酶：,R,1,=Arg,肽链,水解位点,谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶,新版生物化学蛋白质,第154页,化学法：,可取得较大肽段,溴化氰,(Cyanogen bromide),水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸羧基所形成肽键。,新版生物化学蛋白质,第155页,羟胺（,NH,2,OH,）：,专一性断裂,-Asn,-,Gly-,之间肽键。也能部分裂解,-Asn,-,Leu-,之间肽键以及,-Asn,-,Ala-,之间肽键。,新版生物化学蛋白质,第156页,一级结构测定步骤,Edman,法,（,1,）,测定蛋白质分子中多肽链数目（,2,）拆分蛋白质分子中多肽链,（,3,）断裂多肽链内二硫键（,4,）,测定多肽链氨基酸组成（,5,）,分析多肽链,N,末端和,C,末端,（,6,）多肽链部分裂解成肽段,（,7,）测定各个肽段氨基酸次序,（,8,）确定肽段在多肽链中次序（,9,）确定多肽链中二硫键位置,新版生物化学蛋白质,第157页,蛋白质测序方法,氨基酸序列分析仪,-,化学测序,（,Edman,反应原理）,酶降解法,（氨肽酶、羧肽酶）,质谱法,（,MS,）,首先修饰肽链中极性基团，如 氨基乙酰化（醋酸酐）、,OH,、,COOH,等甲基化（,CH,3,I,）。经质谱仪取得蛋白质气相离子,MS/MS,测序普通在,25AA,左右,适于微量多肽,C=O,和,N-H,几乎都平行于螺旋轴,;,3,、每个氨基酸残基,N-H,与前面第四个氨基酸残基,C=O,形成氢键，肽链上全部肽键都参加氢键形成。,4,、多肽链中存在脯氨酸时，,-,螺旋中止，并产生一个“结节”,（,1,）,螺旋（,helix,）,新版生物化学蛋白质,第180页,CH,CH,2,CH,2,CH,2,=-57,、,=-48,新版生物化学蛋白质,第181页,形成原因,：与组成和排列次序直接相关。,多态性,：多数为右手（较稳定），亦有少数左手螺旋存在（不稳定）；存在尺寸不一样螺旋。,惯用,3.6,13,-,螺旋,代表,-,螺旋，,3.6,指每圈螺旋包含,3.6,个氨基酸残基，,13,表示氢键封闭环内含有,13,个原子。,其它螺旋形式：,3,10,-,螺旋和,-,螺旋（,4.4,16,螺旋）,新版生物化学蛋白质,第182页,right-handed helix left-handed helix,新版生物化学蛋白质,第183页,R,侧链对,-,螺旋影响,:,R,侧链大小和带电性决定了能否形成,-,螺旋以及形成,-,螺旋稳定性。,多肽链上连续出现带同种电荷基团氨基酸,残基，则因为静电排斥，不能形成链内氢键，从而不能形成稳定,-,螺旋。,Gly,角和,角可取较大范围，在肽中连续存在时，使形成,-,螺旋所需二面角机率很小，不易形成,-,螺旋。,R,基大（如,Ile,）不易形成,-,螺旋,Pro,中止,-,螺旋。,R,基较小，且不带电荷氨基酸利于,-,螺旋形成。,新版生物化学蛋白质,第184页,（,2,）,-,折叠,-pleated sheet,也是,1951,年,Pauling,等人提出。,-,折叠片特点：,多肽链主链处于较伸展波折形式（锯齿状），相邻肽链之间或同一肽链不一样肽段借助氢键彼此连成片状结构（主链,N,H,和,C=0,之间形成氢键）。,氢键与肽链长轴靠近垂直。,侧链,R,基交替地分布在片层平面两侧。,新版生物化学蛋白质,第185页,-,折叠有两种类型。一个为平行式，即全部肽链,N-,端都在同一边。另一个为反平行式，即相邻两条肽链方向相反。,反平行重复周期（肽链同侧两个相邻同一基团之间距离）为,0.7nm,，平行为,0.65nm,。,（,2,）,-,折叠,-,折叠存在于球状及纤维状蛋白质（,-,角蛋白）,中。,新版生物化学蛋白质,第186页,N,N,N,平行式,反平行式,C,N,N,新版生物化学蛋白质,第187页,（,3,）,-,转角,-turn,在,-,转角部分，由四个氨基酸残基组成,;,弯曲处第一个氨基酸残基,-C=O,和第四个残基,N-H,之间形成氢键，形成一个稳定环状结构。,这类结构主要存在于球状蛋白分子表面。,新版生物化学蛋白质,第188页,（,4,）,无规则卷曲,没有一定规律自由盘曲，往往是酶结合部位。,新版生物化学蛋白质,第189页,核糖核酸酶分子中二级结构,-,螺旋,-,折叠,-,转角,无规卷曲,新版生物化学蛋白质,第190页,示例：纤维状蛋白,角蛋白,胶原蛋白,-,角蛋白（头发）,-,角蛋白（丝心）,弹性蛋白,一根毛发周围是一层鳞状细胞,(scaIe cell),，中间为皮层细胞,(cortical celI),。皮层细胞横截面直径约为,20,m,。在这些细胞中，大纤维沿轴向排列。所以一根毛发含有高度有序结构。,毛发性能就决定于,螺旋结构以及这么组织方式。,新版生物化学蛋白质,第191页,角蛋白,是毛发主要蛋白,三股右手,螺旋向左缠绕,原纤维,9+2,电缆式排列成微原纤维（,8nm,）,聚合成大纤维,毛发结构单元,新版生物化学蛋白质,第192页,卷发,(,烫发,),生物化学基础,永久性卷发,(,烫发,),是一项生物化学工程,(biochemical engineering),角蛋白在湿热条件下能够伸展转变为,构象，但在冷却干燥时又可自发地恢复原状。,这是因为,角蛋白侧链,R,基普通都比较大，不适于处于,构象状态，另外,角蛋白中螺旋多肽链间有着很多二硫键交联，这些交联键也是当外力解除后使肽链恢复原状,(,螺旋构象,),主要力量。这就是卷发行业生化基础。,新版生物化学蛋白质,第193页,新版生物化学蛋白质,第194页,丝心蛋白,(fibroin),：这是蚕丝和蜘蛛丝一个蛋白质。丝心蛋白含有抗张强度高，质地柔软特征，但不能拉伸。,丝心蛋白是经典,反平行式,-,折叠片,，多肽链取锯齿状折叠构象。,新版生物化学蛋白质,第195页,天然,-,角蛋白除了丝心蛋白外，还在大多数鸟类、爬行,动物羽毛、皮肤、爪及鳞片中存在。,有大侧链,AA,存在，处于无规则区域，增加了伸展度。,新版生物化学蛋白质,第196页,四、超二级结构和结构域,1,、超二级结构：是指蛋白质中相邻二级结构单元,组合在一起，形成有规则、在空间上能识别,二级结构组合体。,已知超二级结构有三种基本组合形式：,、,X,和,。,超二级结构,（作为纤维状蛋白主要结构元件）,新版生物化学蛋白质,第197页,新版生物化学蛋白质,第198页,Rossman,折叠,（,-,螺旋束）,新版生物化学蛋白质,第199页,-meander,Greek key topology,rare,(,回形拓扑结构,),(,波折,),-hairpin,(,-,发夹,),新版生物化学蛋白质,第200页,四、超二级结构和结构域,2,、结构域：多肽链在二级结构或超二级结构基础上，深入卷波折叠形成几个相对独立、近似球形三维实体。,超二级结构和结构域是组成蛋白质三级结构结构单元,新版生物化学蛋白质,第201页,结构域这一折叠层次出现不是偶然,含有结构上意义,含有功效上意义,结构域是在大蛋白质分子内部所形成两个或多个在空间上能够显著区分局部区域。,结构域含有独特空间构象；与分子整体以共价键相连；并负担特定生物学功效；一个蛋白质分子中结构域之间能够相同或不一样。,新版生物化学蛋白质,第202页,丙酮酸激酶结构域,4,/,结构域,3-P-,甘油醛脱氢酶结构域,2,+,结构域,木瓜蛋白酶结构域,1,无规则卷曲,+-,螺旋结构域,木瓜蛋白酶结构域,2,无规则卷曲,+-,回折结构域,新版生物化学蛋白质,第203页,卵溶菌酶三级结构中两个结构域,-,螺旋,-,转角,-,折叠,二硫键,结构域,1,结构域,2,新版生物化学蛋白质,第204页,五蛋白质三级结构,蛋白质三级结构,(,Tertiary Structure,),是指在二级结构、,超二级结构和结构域,基础上，肽链不一样区段侧链基团相互作用在空间深入盘绕、折叠形成包含主链和侧链构象在内特征三维结构。,维系这种特定结构力主要有二硫键、氢键、疏水键（疏水作用）、离子键和范德华力等。尤其是疏水键，在蛋白质三级结构中起着主要作用。,新版生物化学蛋白质,第205页,肌红蛋白三级结构,哺乳动物肌肉中储存氧和运输氧结构蛋白,由一条多肽链组成，含,153,个氨基酸残基，球状分子，有一个血红素辅基。,全链折叠成八段,-,螺旋，整个分子呈一个外圆中空结构，血红素辅基埋在中间。,含有极性氨基酸侧链分布在分子外部，疏水基团藏在分子内部，所以肌红蛋白是水溶性。,新版生物化学蛋白质,第206页,1963,年，,Kendrew,；,肌红蛋白,X,晶体分析分三个阶段完成：,X-,射线结晶学分析,三个阶段,(,揭示原子空间位置,),：,在,3mol/L,硫酸铵沉淀得到结晶体。,1957,，,分辨率,0.6nm,多肽主链折叠和走向,1959,，,分辨率,0.2nm,能够识别分子侧链基团,1962,，,分辨率,0.14nm,识别全部氨基酸,新版生物化学蛋白质,第207页,固定血红素辅基；,保护血红素铁,Fe(),免遭氧化,（分子内部疏水环境）；,通常情况下,氧使二价铁氧化,;,血红素单独也使其氧化；在肌红蛋白分子内部,不易被氧化,因为当结合氧时发生暂时性电子重排,氧被释放后铁仍处于亚铁态,能与另一氧分子结合,.,为,O,2,提供一个适当结合部位,肌红蛋白和血红蛋白在进化中形成多肽微环境作用：,新版生物化学蛋白质,第208页,蛋白质不能直接与氧发生可逆结合,过渡金属低氧态（尤其是,Fe,2+,和,Cu,+,）含有很强结合氧倾向,肌红蛋白和血红蛋白选择了,Fe,2+,作为氧结合部位,铁原子能够是亚铁或高铁氧化态。,只有亚铁态蛋白质才能结合,O,2,。,一些节肢动物血蓝蛋白中结合氧是,Cu,+,血红素辅基,血红素辅基位于一个疏水洞穴中，这么可防止其亚铁离子被氧化。亚铁离子与卟啉形成,4,个配位键，第五个配位键与,93,位,His,结合，空余一个配位键可与氧可逆结合。,新版生物化学蛋白质,第209页,六、蛋白质四级结构,蛋白质四级结构,(,Quaternary Structure,),是指由多条各自含有一、二、三级结构肽链经过非共价键连接起来结构形式；各个亚基在这些蛋白质中空间排列方式及亚基之间相互作用关系。,这种蛋白质分子中，最小单位通常称为,亚基,或亚单位,Subunit,，它普通由一条肽链组成，但有,亚基由两条或多条多肽链组成,，这些多肽链间多以二硫键相连。亚基单独存在时无生物学活性。,维持亚基之间化学键主要是,疏水作用,。,由,2,个或多个亚基聚集而成蛋白质经常称为,寡聚蛋白。,由,1,条肽链组成仅含有三级结构蛋白质称为,单体蛋白。,维持蛋白质四级结构作用力同三级结构。,新版生物化学蛋白质,第210页,血红蛋白四级结构：,血液中运输,O,2,和,CO,2,功效，,血红蛋白还能和,H,+,结合，从而能够维持体内,pH,。,由四个亚基组成多聚体（,2,2,），,分子量,65000,链由,1