显微镜的构造、使用及显微计数.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验一 显微镜的构造、使用及显微计数,为什么要用显微镜？原理？,如何使用显微镜？,使用显微镜我们可以做什么？仅仅限于观察吗?,显微镜的使用,要知道的几个重要的分辨率,人眼 0.2mm/250mm,光学显微镜：0.2um,电子显微镜：0.2nm,(10X),罗伯特虎克制造的显微镜（,1665）,放大倍数：140倍,细胞壁,列文虎克和他的显微镜（约1680）,第一个看到活细胞,2 显微镜的光学原理,2.1折射和折射率 光线在均匀的各向同性介质中，两点之间以直线传播，当通过不同密度介质的透明物体时，则发生折射现象，这是由于光在不同介质的传播速度不同造成的。,2.2凸透镜的五种成象规律(1)当物体位于透镜物方二倍焦距以外时，则在象方二倍焦距以内、焦点以外形成缩小的倒立实象；,(2)当物体位于透镜物方二倍焦距上时，则在象方二倍焦距上形成同样大小的倒立实象；,(3)当物体位于透镜物方二倍焦距以内，焦点以外时，则在象方二倍焦距以外形成放大的倒立实象；,(4)当物体位于透镜物方焦点上时，则象方不能成象；,(5)当物体位于透镜物方焦点以内时，则象方也无象的形成，而在透镜物方的同侧比物体远的位置形成放大的直立虚象。,2.3显微镜的成像原理,显微镜和放大镜起着同样的作用，就是把近处的微小物体成一放大的像，以供人眼观察。只是显微镜比放大镜可以具有更高的放大率而已。,物体位于物镜前方，离开物镜的距离大于物镜的焦距，但小于两倍物镜焦距。所以，它经物镜以后，必然形成一个倒立的放大的实像AB。AB靠近F2的位置上。再经目镜放大为虚像AB后供眼睛观察。目镜的作用与放大镜一样。所不同的只是眼睛通过目镜所看到的不是物体本身，而是物体被物镜所成的已经放大了一次的像。,为什么要用显微镜？原理？,如何才能让显微镜拥有更高的分辨率？,3 显微镜的几个基本概念,3.1 光源：能发射光波的物体。,可见光频率范围：7.51014-3.91014 Hz。,真空中对应的波长范围：390nm 760nm,相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红,3.2,分辨率,(鉴别距离)：显微镜能分辨的最小距离，用D表示。显微镜的鉴别距离越小，分辨率越高。,D=0.61/n sin,D：分辨率:光波的波长 n:介质折射率 :,物镜镜口角,3.3,孔径角,：由标本上一点发出的进入物镜最边缘光线L和进入物镜中心光线OA之间的夹角,称为孔径角。,3.4,数值孔径(N.A),：令NA=nsin,叫物镜的数值孔径。,数值孔径与显微镜的分辨率有密切关系，,越短，NA越大，,分辨率越高。同样的倍数的物镜,数值越大,则光通亮越大,分辨率越高,物镜数值孔径,3.9工作距离,工作距离也叫物距，即指物镜前透镜的表面到被检物体之间的距离。,在物镜数值孔径一定的情况下，工作距离短孔径角则大。,数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。,提高显微镜分辨率的方法：,（1）,增大物镜的数值孔径,在物镜和盖玻片之间充以,n,较大的油，如香柏油,n,=1.52,不仅使,n,增大，而且孔径角,也增大。,（2）,用短波长的光照射,如紫外光显微镜，电子显微镜。,显微镜油镜使用的原理,油镜使用的原理,1.香柏油的折射率与玻璃接近，提高了视野的照明度。,2.提高了显微镜的分辨率,显微镜的结构,组成,光学放大系统,照明系统,机械和支架系统,物镜,光源,折光镜,聚光镜,滤光片,目镜,光学显微镜基本结构,：,1.,照明灯(Lamp),2.,聚光器(Condenser),3.,载物台和切片夹(Mechanical stage and specimen retainer),4.,推进器(Mechanical stage adjustment knob),5.,物镜(Objectives),6.,粗细螺旋(Course and fine focus knob),7.,目镜(Oculars),8.,照相机等接口(Connection to camera,etc.),4.1物镜,物镜(objective)是光学显微镜成像系统中决定其分辨率或叫分辨本领的最关键部件。,(1)消色差物镜(achromat),色差校正使可见光中红光和蓝光聚焦于一点，而黄绿光则聚焦于另一点。能够消除光谱中红光和蓝光所形成的色差。这种物镜与目镜配用时可达到消色差物镜所要求的光学性能。,(2)复消色差物镜(apochromat),是性能最高的物镜。能消除可视光中黄、红、蓝即包括几乎所有谱线在成像过程中所造成的色差。,(3)平象物镜,它们所成的影象基本上是平的，象场弯曲很小，不会发生视野中心与边缘不能同时准焦的现象，因此对目视观察及显微摄影都极为方便。平象物镜由于将弯曲的影象展平，在同样放大倍数下它成的影象比用一般物镜要大一点。在平象物镜的金属外框上，刻有Flanachr、planapo、plan 等字样。,(4)相差物镜,相差物镜(Phasencontrast objective)的一个透镜片上喷涂着一层环状金属膜板叫相位板。相位板是相差显微镜的关键部件。它和相差显微镜的聚光镜上的的环状光栏相配合使用。外壳上刻有Ph标记,物镜结构,物镜标识,像差,球差,象散,慧差,场曲,负畸变,正畸变,色差,球差校正,色差校正,4.2目镜,目镜的作用是把物镜放大的实象再放大一级，并把物象映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目镜只是起放大作用。对于物镜不能分辨出的结构，目镜放的再大，也仍然不能分辨出。,4.3聚光镜,聚光镜装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。,聚光镜光栏,所谓光栏，从广义的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可认为光栏。,聚光镜光栏作用,（1）改变聚光镜的数值孔径以便与物镜的数值孔径相匹配，可调整图象的分辨率和反差。,（2）辅助调整亮度。,聚光器数值孔径,为什么要用显微镜？原理？,如何使用显微镜？,使用显微镜我们可以做什么？仅仅限于观察吗?,显微镜的使用,2.显微镜的使用方法,3.使用显微镜的注意事项,显微镜的使用,一、取镜和安放,1右手握住镜臂，左手托住镜座,2把显微镜放在实验台上，略偏左（显微镜放在距实验台边缘7厘米左右）。安装好目镜和物镜。,显微镜的使用,二、对光,3转动转换器，使低倍物镜对准通光孔(物镜的前端与载物台要保持5厘米的距离)。,显微镜的使用,显微镜的使用,三、观察,5把所要观察的玻片标本放在 载物台上，用压片夹压住，标本要正对通光孔的中心。,6转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓下降，直到物镜接近玻片标本为止（眼 睛看着物镜，以免物镜碰到玻片标本）。,7向目镜内看，同时反方向转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直 到看清物像为止。再略微转动细准焦螺旋，使看到的物像更加清晰。,显微镜的使用,主要是油镜的使用,1.,用前检查：零件是否齐全，镜头是否清洁。,2.,调节光亮度,3.,低倍镜观察：粗调、细调,4.,依次再进行中倍、高倍观察,5.,油镜观察：高倍镜下找到清晰的物象后，提升聚光镜，在标本中央滴一滴香柏油，使油镜镜头浸入香柏油中，细调至看清物象为止。,6.,换片：另换新片，必须从第三条开始操作。,7.,用后复原：观察完毕，上悬镜筒，先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾取少量二甲苯擦去残留的油，最后用擦镜纸擦去残留的二甲苯，后将镜体全部复原。,3.使用显微镜的注意事项,（1）显微镜安放位置,显微镜应安放在离桌边缘5 cm、镜筒向前，并讲清显微镜位置稍靠左侧的道理（两眼同时睁开观察，眼不易疲劳，便于绘图。）,（2）对光根据光线的强弱来选择平面镜或凹面镜；用高倍镜进行对光，把低倍镜位置放低；在转动转换器时，物镜到位，光圈调节好，视野光线均匀、明亮.,3）迅速找到要观察的物像 按简明、合理的程序操作。先使用视野宽的低倍镜，把要观察的材料放通光孔中央，放下镜筒使物镜下端与装片的距离约1 cm，沿逆时针方向徐徐调节粗准焦螺旋，同时左眼注视视野，直到看清物像。如果第一次标本未进入视野，那么要重新操作，在调节粗准焦螺旋的同时，移动装片，直到看见物像为止。在具体操作时，也可以装片表面杂质或气泡为参照物，当杂质出现时，表明物距基本调好，再移动装片，即可找到所要观察的物像。,3.使用显微镜的注意事项,（4）正确使用高倍物镜的方法 由于高倍物镜的工作距离小，镜头易损坏，用高倍物镜前先换上高倍的目镜，再直接换上高倍物镜，并且把光圈开大。（5）重视准焦螺旋的使用 在使用高倍物镜时，不要调节粗准焦螺旋，避免物镜损坏、装片压烂。（6）不是倍数越大，越清晰 如果目镜倍数过大，得到的放大虚像则很不清晰。在低倍镜下能看清楚的物像，不必用高倍镜观察。,3.使用显微镜的注意事项,（7）显微镜的保养 显微镜是精密的放大仪器，要爱护显微镜。轻拿轻放，不能用手或布去擦试镜头，使用倾斜关节时，倾斜角度不能太大。实验完毕，盖上镜头盖，移去载物台上的玻片，转动转换器，使两个物镜分开至两旁，降下镜筒，装入镜箱内。,3.使用显微镜的注意事项,光学显微镜的维护,显微镜要轻拿轻放。,严禁将表面有水的载片放到显微镜上。,从低倍转入高倍应能看到图象，否则需转入低倍另行调节、查找原因。,每次使用完毕后将将光源亮度调至最低。,临时不用显微镜只需将光源亮度调至最低而无需关闭。忌频繁开关显微镜电源。,镜头脏污只能用专用工具经专门程序清洗。,使用完毕等灯箱冷却后罩上防尘罩或放入箱内，并存于干燥无尘处。,清洁工具,清洁液配方：1份无水乙醇3份乙醚,擦拭方法,注意,塑料表面勿用乙醇乙醚混合液擦洗。,严禁用干擦镜纸擦拭镜头。,物镜严禁拆卸并防止振动。,显微镜的使用原则,低倍镜,高倍镜,高倍镜,字母,肝切片,血涂片,为什么要用显微镜？原理？,如何使用显微镜？,使用显微镜我们可以做什么？仅仅限于观察吗?,细胞数量的测定,1明确细胞计数板计数的原理,2掌握使用细胞计数板进行细胞计数的方法,基本原理,显微镜直接计数法是将小量待测样品的悬浮液置于一种特别的具有确定面积和容积的载玻片上，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。,Thoma血球计数板,A.正面图 B.纵切面图,1.血球计数板 2.盖玻片 3.计数室,16小格 25大格计数室,25小格 16大格计数室,计数室的两种刻度形式,（10 x）,注意事项,:,加样时计数室不可有气泡产生。,B.,调节显微镜光线的强弱适当。,1.取清洁无油的血球计数板，在计数室上面加盖玻片。,2.取细胞悬液，摇匀，用滴管由盖玻片边缘滴一小滴，使自行渗入，计数室内不得有气泡。,3.静止5min后，用低倍镜观察并将计数室移至视野中央。,4.在高倍镜下计数：随机计数四大格的平均值，最后再换算到每mL菌液中的含菌数。,四、实验内容,5.计算方法：,6.注意事项：压在方格线上的菌体，以压在上线和左侧线上的细胞计入本格内。,7.计数完毕后，血球计数板要立即清洗干净，并用吸水纸吸干，最后用擦镜纸擦干净，并放回盒内,。,（X1+X2+X3+X4）,4,X 10 X,1000 x 稀释倍数,细胞数/mL=,实验内容,