电泳分离概述.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,1,电泳分离,2,主要内容,1,概述,2,电泳的分类,3,聚丙烯酰胺凝胶电泳,4,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,5,等电聚焦电泳,3,1809,年俄国物理学家,Peiice,首次发现电泳现象,，他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变浑浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。,1909,年,Michaelis,首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳,。他用不同,pH,的溶液在,U,形管中,测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。,1937,年，,Tiselius(,瑞典,),将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行,自由溶液电泳,，第一次将,人血清提取的蛋白质,混合液分离出白蛋白和,、,、,球蛋白。,一、概述,1,、电泳的发展史,4,1948,年,Wieland,和,Fischer,重新发展了以,滤纸作为支持介质的电泳方法,，对氨基酸的分离进行过研究。,从本世纪,50,年代起，特别是,1950,年,Durrum,用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质,(,如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等,),作为支持介质的区带电泳方法。,5,电泳,：带电荷的物质（如蛋白质、核酸等）处于惰性支持介质（固态或液态）中，在电场的作用下，向其,相反的电极方向泳动,的现象。,电泳分离,：带电物质在电场的作用下，因其所带,电荷性质,、,电荷数量,以及,分子量大小,的不同而产生的,泳动方向,、,泳动速度,的不同，最终使得混合组分得以分离的操作单元。,2,、电泳的概念,6,电泳分离的基础建立在蛋白质是,带电颗粒,这一事实上的。蛋白质的电荷来源于氨基酸的,离子化侧链基团,，包括,酸性残基,，、,碱性残基,、,络氨酸残基,以及,荷电的非蛋白质组分如脂类或者碳水化合物,。大多数这些酸和碱都很弱，使得蛋白质的整体电荷具有很大的,pH,依赖性,。而在一特定的,pH,下，不同蛋白质分子由于,氨基酸组成不同,，所带,电荷的电性和电量也不同,，由此可进行蛋白质的分离和分析。,3,、电泳分离的基本原理,9,内在特性,：颗粒性质（静电荷量、颗粒大小、形状）,外在特性,：电场强度、溶液的离子强度、,pH,值、电渗作用、电泳介质的性能。,1,）颗粒性质,Q,越大、,r,越小、形状越接近球形，,v,越快。,4,、影响迁移率的因素,10,2,）电场强度,单位长度的电位降称为,电场强度,，也叫,电势梯度,（,V/m,）。如电泳槽长,20cm,，电压,200V,，则电场强度,20020=10V/cm,。,电场强度越大，电泳速度越快，但是会产生大量热量,，需要配备冷却设备。,常压电泳,E,：,2,10V/cm,电压：,100,500V,，大分子物质分离。,高压电泳,E,：,20,200V/cm,电压,500V,，小分子物质分离。,11,3,）溶液离子强度,离子浓度,过高,引起带点质点吸引相反粒子聚集其周围，形成一个与带点质点电荷相反的离子氛，通过降低带电粒子量和增加阻力使运动质点,迁移速率降低,；,则电流过大、产热过多，使,区带变宽,、,蛋白质变性,。,12,溶液离子强度,过低,降低缓冲液的总浓度和缓冲剂量，不宜维持溶液的,pH,值，进而影响,溶质的带电量,；,其次蛋白质之间有时候会发生相互静电作用，形成更大的分子团，影响,迁移速率,；,而且电泳过程中由于电子流动产生热量，所以解决,设备温度控制问题,成为电泳和电色谱设备放大的难题。,13,4,）溶液,pH,值,溶液的,pH,值决定,带电物质的解离程度,，也决定物质所带,净电荷的多少,.,对蛋白质，氨基酸等类似两性电解质，,pH,值离等电点越远，粒子所带电荷越多，泳动速度越快，反之越慢,。因此，当分离某一种混合物时，应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的,pH,值，以利于各种蛋白质的有效分离,.,为了保证电泳过程中溶液的,pH,值恒定，必须采用缓冲溶液,14,5,）电渗作用,电场作用下，溶液对固体支撑物的相对运动称为,电渗,。,固体支撑物多孔且带有,可解离的带电基团,，解离后,常吸附溶液中带正电或负电的反离子,，这些反离子不是固定的，随着电压梯度运转到正极或负极，直至被下一带电基团所捕获。,总体效果就是溶液在电场作用下向正极或负极移动。,电渗影响带电质点的迁移速度。但在,保持一定的电渗流是有益的,，比如免疫电流。,15,6,）电泳介质的性能,样品的,扩散,或,对流,会干扰样品的分离，为此可以使用支持介质以防止电泳过程中的对流和扩散。支持介质必须是,化学惰性的，且均匀，化学稳定性好，且具有合适的渗流。,16,5,、检测方法,电泳结束后，被分离的蛋白质区带仍然保持在胶内，这时可以通过染色而显示出分离图谱，从而检测样品的分离情况。常用的,全蛋白质染色方法,有：,考马斯亮蓝法,、,银染色法，荧光染色法。,考马斯亮蓝法,通过范德瓦尔斯键结合到蛋白质的碱性集团上，适用于对蛋白质和肽进行染色。,通常先用三氯乙酸和,/,或甲醛等试剂,固定凝胶上的蛋白质,，然后将凝胶,浸泡在染色液中染色,，最后将凝胶浸与乙酸,/,乙醇脱色液中,脱色,目的为了除去多余的燃料，直至背景清晰。,染色后，考马斯亮蓝凝胶可以湿保存（浸泡在,10%,乙酸溶液中密封）或者干保存,。,17,银染色法,银染色法是更灵敏的蛋白质染色方法，银染时蛋白带上的,AgNO,3,被还原成金属,Ag,而沉积在蛋白带上。,现在常使用即用型银染试剂盒进行银染。银染过程中蛋白质先固定、在显色。常用的固定剂有戊二醛，乙醇、甲醇、乙酸、三氯乙酸，固定能阻滞蛋白质在凝胶中的扩散。银染的显色方法主要有化学显示和光显示两种。,18,荧光染料法,荧光染料可以时染料本身发荧光，或者是染料与蛋白质的反应产物发荧光。荧光染料法分为电泳前预标记和电泳后再标记两种方法。,电泳前预标记蛋白质主要采用丹磺酰氯、荧光胺、领苯二甲己二醛等，特别是荧光胺近年来采用较多。电泳后蛋白带的迅速定位可以用邻苯二甲基二醛、荧光胺、,1-,苯胺,-8-,萘磺酸盐进行荧光标记。,19,5,、电泳的实验一般方法步骤,1,）制胶,2,）加样,3,）电泳,4,）检测,5,）电泳结果的保存,20,（,1,）电泳仪,：,为电泳提供稳定直流电源的装置,。,常压电泳仪（,600V,）,高压电泳仪（,3000V,）,超高压电泳仪（,30000V,50000V,）,6,、电泳常用设备,21,（,2,）电泳槽：,电泳系统的核心部分。,自由界面电泳槽,管状电泳槽,板状电泳槽,22,（,3,）附属设备：,外循环恒温系统,:,高电压会产生高热，,需冷却。,灌胶模具：制胶，,玻璃板和梳子。,23,1,、按是否产生区带,自由界面电泳,：,移动界面电泳，指在没有支持介质的溶液中进行的电泳，分离后不产生区带。,区带电泳,:,指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。,6,、,二、,电泳的分类,24,2,、,按,支持介质种类的不同,，区带电泳可分为：,纸电泳,。,色谱电泳,醋酸纤维素薄膜电泳,凝胶电泳：以淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶为电泳载体。,聚焦电泳：如等电聚焦电泳、密度梯度电泳、亲和电泳等。,聚丙烯酰胺,和,琼脂糖,是目前实验室最常用的两种支持介质。,25,3,、按,电泳次数、方向,一维电泳：仅一个方向电泳一次。,二维电泳：平面,X,轴、,Y,轴方向各电泳一次。,4,、按,操作方式,分,连续电泳：连续进样。,间歇电泳：分批进样。,5,、按,电泳介质是否均匀分,连续介质电泳：电泳介质密度均匀一致。,不连续介质电泳：电泳介质上 层密度低为浓缩层，下层密度高为分离层。,26,6,、按电泳设备分,1,）,平板电泳：,水平平板电泳,：有分置于两侧的缓冲液糟和中间的水平冷板的凝胶组成，缓冲液与凝胶通过,滤纸桥或者凝胶条,搭连。水平平板电泳的特别优势在于,电极缓冲液用量很少,，缓冲液凝胶条使用很方便，特别是当分析标记蛋白质时可大量减少放射性污染；另外就是,良好的冷却系统,，从而可以采用高点压，既提高了分辨率，又缩短了电泳时间。,垂直平板电泳,：上下两个电泳槽，中间经垂直平板相连，凝胶加在两块垂直平行玻璃或塑料板之间。,27,一般平板电泳,：凝胶载体为惰性材料，只起支撑作用，无分离作用，如淀粉凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。,特殊平板电泳,：载体除支持作用外，主要起分离作用，如等电聚焦电泳、,pH,梯度电泳、密度梯度电泳、亲和电泳等,2,）,管状电泳：,又叫圆盘电泳，有上下两个电泳槽，上电泳槽有若干小孔，用于插电泳管，现在电泳管越来越细，以提高分辨率和微量化。各电泳管分别制胶，因此不够简单、均一、准确，目前很少使用了。取而代之的是平板电泳，而自身逐渐演变成更细更长的,毛细管电泳,。另外由于凝胶管与电泳液直接接触，容易导致液体泄漏、短路、断路等。,28,29,聚丙烯酰胺凝胶电泳（,polyacrylamide gel electrophoresis,，,PAGE,）是以,聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质,的一种电泳方法。,聚丙烯酰胺凝胶是由,丙烯酰胺单体,（,acrylamide,，简称,Acr,）和交联剂,N,，,N-,亚甲基双丙烯酰胺,（,methylane bisacrylamide,，简称,Bis,）在,催化剂,和,加速剂,作用下聚合而成的三维网状结构的凝胶。,PAGE,具有,电泳,和,分子筛,的双重作用。,PAGE,是目前最常用的电泳方法。,三、,聚丙烯酰胺凝胶电泳,30,1,、原理,聚丙烯酰胺凝胶电泳,一方面根据蛋白质电荷密度,，也就是在缓冲液中不同蛋白质间同性静电荷的差异，,另一方面基于分子筛效应,，即与分子大小和形状有关，因此用聚丙烯酰胺凝胶电泳不仅能分离各种蛋白质分子的混合物，还可以研究其特性，如电荷、分子量、等电点乃至构想，并且可以用于蛋白质纯度的鉴定。,另外不连续的,PAGE,，对蛋白质的分离不仅基于上面的分子筛效应，还基于对,样品的浓缩效应。,31,2,、,分离效应,PAGE,根据其有无浓缩效应，分为：,连续电泳,（,continuous electrophoresis,）：采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统；,不连续电泳,（,discontinuous electrophoresis,）：,采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系；,电荷效应,不连续,PAGE,分子筛效应,浓缩效应,连续,PAGE,32,1,）,电荷效应,:,分离胶中，蛋白质表面,净电荷不同,，,迁移率不同,。,2,）,分子筛效应：,大小和形状不同,的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受,阻滞的程度不同,而表现出不同的迁移率。,在直流电场作用下电泳情况示意图,图中,A，B，C,均为阴离子,分子量大小依次为,M,A,=M,B,M,C,，,所带电荷量相同,Q,A,=,Q,B,=,Q,C,。,33,3,）,浓缩效应：,使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。,34,8.3,8.3,8.9,6.7,1.,凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的,孔径不同,，,上层为大孔径的浓缩胶,，,下层为小孔径的分离胶,。,2.,缓冲液离子组成,及各层凝胶的,pH,不同,。,电极缓冲液,为,pH8.3,的,Tris-,甘氨酸缓冲液，,浓缩,胶为,pH6.7,的,Tris-HCl,缓冲液，而,分离胶,为,pH8.9,的,Tris-HCl,缓冲液。,3.,在电场中形成,不连续的电位梯度,。,因此，在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即,样品的浓缩效应,，凝胶的,分子筛效应,和,电荷效应,，提高了分辨率。,3,、,系统的不连续性表现在以下几个方面,35,4,、聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：,1,）化学催化系统：,AP-TEMED,催化剂：,过硫酸铵,（,ammonium persulfate,，,AP,）,加速剂：,TEMED,（,N,，,N,，,N,，,N,-,四甲基乙二胺）,2,）光催化系统：核黄素光,催化剂,:,核黄素（维生素,B,2,）,引发剂,:,光,TEMED,的存在，可加速聚合。,.,CH,2,=CH,C=O,NH,2,CH,2,=CH,C=O,NH,CH,2,NH,C=O,CH,2,=CH,-CH,2,-CH-,CH,2,-CH-,n,CH,2,-CH-,C=O C=O C=O,NH,2,NH,2,NH,CH,2,NH,C=O,-CH,2,-CH-,CH,2,-CH-,n,CH,2,-CH-,C=O C=O,NH NH,2,丙烯酰胺,N,N,-,甲叉双丙烯酰胺,聚丙烯酰胺,37,38,（,1,）催化剂和加速剂的浓度：,浓度小易导致聚合速度慢；浓度过大则易导致电泳时的烧胶以及电泳带的畸变；一般控制使聚合过程在,40,60,分钟内完成。,（,2,）系统,pH,值：,酸性条件、碱性条件均可，但仍然存在一个最佳,pH,值，以获得最佳的聚合结果。,（,3,）温度：,低温下聚合导致凝胶变脆和混浊，适当提高温度可以使凝胶透明而有弹性。,（,4,）分子氧：,分子氧的存在会阻碍凝胶的化学聚合；抽气。,（,5,）系统纯度：,金属离子会影响凝胶的聚合。,5,、,影响丙烯酰胺聚合的主要因素,39,聚丙烯酰胺凝胶：,丙烯酰胺,N,N,亚甲基双丙烯酰胺聚合而成,40,凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着度取决于凝胶总浓度（,T,）,和交联度（,C,）。,T=C=,凝胶浓度越大（小），孔径越小（大），可分离分子量较小（大）的颗粒,。,6,、凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系,Acr,（,g,）,+Bis,（,g,）,V,（,ml,）,X100%,Acr,（,g,）,+Bis,（,g,）,Bis,（,g,）,X100%,41,聚丙烯酰胺凝胶的有效孔径取决于总浓度，随浓度的增加而降低。,42,有效孔径决定蛋白质的分离,43,44,7,、特别注意,丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺对中枢神经系统有损伤作用,.,丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺要避光保存,.,混合的溶液保存不宜超过一个月,.,45,聚丙烯酰胺凝胶的应用,46,聚丙烯酰胺凝胶的应用,47,聚丙烯酰胺凝胶的应用,48,四、,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,（,sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE,）简称,SDS,PAGE,。,是目前测定蛋白质亚基相对分子量（,relative molecular mass,Mr,）的一种最好的办法,。,49,1,、分离原理：,SDS,是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，能,断裂分子内和分子间的氢键,，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而,强还原剂，如二硫苏糖醇、,-,巯基乙醇能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂,。,因此，在样品和凝胶中加入,SDS,和还原剂后，蛋白质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基酸侧链与,SDS,结合后，形成带负电的蛋白质,-SDS,胶束，,所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消除了不同分子间的电荷差异,；,同时，蛋白质,-SDS,聚合体的形状也基本相同,，这就消除了在电泳过程中分子形状对迁移率的影响,50,2,、蛋白质样品用,SDS,处理后亚基的解聚和分子形状的改变,51,3,、影响分离效果的因素,在,SDS-PAGE,中，蛋白质间不存在电荷密度的差别，分离主要依据蛋白质的亚基分子量，因此凝胶浓度和电泳缓冲液是影响,SDS-PAGE,分离效果的主要因素，另外,SDS,的质量也会影响分离效果。,1,）凝胶浓度,凝胶浓度决定,凝胶孔径大小,，进而影响凝胶的分子筛效应。,52,2,）缓冲系统,对于,SDS-PAGE,，由于,SDS,对蛋白质的,助溶作用,以及负电荷的,包裹作用,，蛋白质的分离仅仅依据,亚基的分子大小,，因此缓冲系统的选择只要满足有利于分离并且保持蛋白质的稳定以及不与,SDS,发生相互作用即可。,3,）,SDS,的质量,SDS,的质量，尤其是,烷基类似物,的存在，会严重影响分离，,SDS,的质量也会,干扰蛋白质的复性,。为了获得可重复的结果，只能采用高质量的,SDS,。,53,3,、未知蛋白质分子量的测定,蛋白质的迁移率与分子量的对数呈线性关系，符合下式：,logM,W,=C-bm,M,W,：,分子量；,m,：迁移率；,C,、,b,均为常数,将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据其相对迁移率即可在标准曲线上求得分子量。,54,4,、,SDS,PAGE,的,优缺点,优点,严格依照一个分子参数，即分子大小来分离蛋白质，因此可以广泛用于分子定性；,能使大多数蛋白质溶解，因此可以用于许多分离过程；,分辨率高，分离快速，重复性高；,操作简单，仪器试剂便宜；,缺点,SDS,使蛋白质变性，从而丧失其生物活性，因此难以用特意检测方法获取信息。,55,聚丙烯酰胺凝胶的应用,56,聚丙烯酰胺凝胶的应用,57,五、等电聚焦,，（,IEF,）,利用特殊的一种,缓冲液（两性电解质,）在凝胶（常用,聚丙烯酰胺凝胶,）内制造一个,pH,梯度,，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其,等电点,（,pI,）的,pH,处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带。,58,1,、原理,在,IEF,的电泳中，具有,pH,梯度的介质其分布是从阳极到阴极，,pH,值逐渐增大,。如前所述，蛋白质分子具有,两性解离及等电点,的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一,pH,位点时失去电荷而停止移动，此处介质的,pH,恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（,pl,）。,59,同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，,等电点,是蛋白质组分的,特性量度,，将,等电点不同的蛋白质混合物,加入有,pH,梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的,pH,位置上，形成分离的蛋白质区带。,60,等电聚焦电泳,61,分辨率高；,电泳时间延长，区带越来越窄；,样品可以加在电泳系统的任何部位；,浓度很低的样品也可以进行分离；,可用于准确测定蛋白质或其他两性电解质的等电点。,2,、优点,62,电泳过程要求使用无盐溶液，可能会使某些在无盐溶液中溶解度较低的蛋白质产生沉淀；,电泳后样品中各组分都聚焦到各自的等电点，对某些在等电点时溶解度较低或可能变性的组分不适用。,3,、缺点,63,4,、两性电解质载体,(carrier ampholytes),1),易溶于水，有足够的缓冲能力,以便保,持稳定的,pH,梯度。,2),导电性能好,以保持电场强度的均匀性。,3),分子量小,电泳后易分离除去。,4),化学组成不同于蛋白质,不干扰测定。,5),与样品中各组分不发生化学反应,。,64,两性电解质在溶液中的行为可从两方面看，一方面,溶液的,pH,决定它带电荷的性质,。如溶液是,pH7,，对,pI=9,的两性电解质来说，是处于酸性环境，故带正电荷；但对,pI=3,的两性电解质来说，却是处于碱性环境，故而带负电荷。所以，不同,pI,的两性电解质，在同一环境中带有不同性质和数量的电荷；,另一方面，溶液中的,两性电解质又破坏了水的解离平衡,，,使溶液,pH,有所改变,。当某一两性电解质,pI,较低，即释放质子,(H+),能力较强，使溶液,pH,值下降，这类两性电解质称为酸性两性电解质；反之，,pI,高的可使溶液,pH,值上升，称为碱性两性电解质。,所以，在溶液中的两性电解质一方面,受溶液,pH,值的影响，决定其带电的性质,；另一方面，它又,影响周围环境,(,水溶液,),，使其,pH,值有所改变,。,5,、,pH,梯度的形成,65,等电聚焦电泳的应用,66,等电聚焦电泳的应用,