水产病害学第6章.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 水产动物病原的检测技术,重要内容,第一节 抗体制备,.,免疫原的制备,一、颗粒,(,细胞,),性抗原制备,二、可溶性免疫原制备,三、人工抗原的制备,四、佐剂,绵羊红细胞的制备流程图,摇动,15-20min,4,可保存,3,周,取适量,NS,洗涤,3,次,2000r/min,10min,NS,稀释至,2,5%,一、颗粒性抗原制备,细菌细胞抗原的制备流程图,液体培养或,斜面培养,3724h,100,水浴,2,2.5h,杀菌,无菌试验,NS,稀释成,8,10,亿,/ml,O,菌体抗原,返回,可溶性抗原,:,蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、,补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸,来源,:,主要是组织和细胞，其成分也比较复杂。,(,一,).,组织和细胞可溶性抗原的制备,(,二,).,蛋白质的提纯,(,三,).,免疫球蛋白片段的制备,(,四,).,纯化抗原的鉴定,返回,二、可溶性抗原制备,1.,酶处理法,2.,冻融法,3.,超声破碎法,4.,表面活性剂处理,(,一,).,组织和细胞可溶性抗原的制备,细胞破碎法,常用酶类：,溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等,方法：,在一定的条件下，能消化细菌和,组织细胞,特点：,此法适用多种微生物；,具有作用条件温和；,内含物成分不易受到破坏；,细胞壁损坏的程度可以控制。,1.酶处理法,原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。,由于超声波发生的空化作用（,cavitation,）使得液,体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成,与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波,所使用的频率从,1kHz,20kHz,不等，间歇进行，避免,长期超声产热，导致抗原破坏。,特点：操作简单，重复性较好，节省时间；,多用于微生物和组织细胞的破碎。,2.,超声破碎法,3.,冻融法,原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及,胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。,方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然,后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织,细胞及细胞内的颗粒可被融破；,特点：此法适用于组织细胞，对微生物细,胞作用较差。,4.,表面活性剂处理,原理：,在适当的温度、,pH,及低离子强度的条,件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，,使膜的渗透性改变或使之溶解。,常用的有：,十二烷基硫酸钠,(SDS,阴离子型,),、,二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯,（非离子型）、新洁尔灭等。,应用：,破碎细菌，且作用比较温和；,提取核酸时，常用此法破碎细胞。,返回,4.表面活性剂处理,蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高的,抗血清通常需要纯化。可采用如下方法：,1.,超速离心法,2.,选择性沉淀法,3.,凝胶层析法,4.,离子交换层析法,5.,亲合层析法,(,二,).,蛋白质的提纯,原理,:,利用各颗粒在梯度液中沉降速度不,同，使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同,密度的梯度层内，达到彼此分离的目的。,特点：,用超速离心或梯度密度离心法纯化抗,原，极难将某一抗原成分分离出来。,应用：,用于少部分大分子抗原和一些比较轻,的抗原物质的分离，如,IgM,、,C1q,、甲状腺球,蛋白、载脂蛋白,A,、,B,等。,1超速离心法,原理：,根据各蛋白质理化特性的差异，采用,各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原,成分沉淀，从而达到纯化的目的。,常用方法：,盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解,度不同）；常用,33,50,饱和度的硫酸胺。,特点：,简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。,应用：,在大量制备中先用此法粗提，再纯化。,2、选择性沉淀法,原理：,凝胶是具有三维空间多孔网状结构的物质，经适当的溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种分 子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝胶网孔结构内，反复受 到阻滞，洗脱较慢。分成大、中、小三种类型。,特点：,简单易行，但掌握不好，分离效果较差。,3凝胶层析法（凝胶过滤法）,原理：,利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位 置，从而使血清中的蛋白质分成,球蛋白、,球蛋白、,球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。,4离子交换层析法,5,亲和层析法（亲和色谱）,原理：,依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗,IgG,附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的,IgG,可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体,(,抗,IgG,),结合；当改变洗脱条件可重新解离，从而将待分离的免疫球蛋白洗脱下来，达到纯化的目的。,优点：,提取纯度高、抗原抗体不失活性。,正常细胞,标记细胞,洗滴,标记细胞,被酶裂解,加入特异,性抗体,其它蛋白,洗涤流失,SDS-PAGE,分离蛋白,亲和层析法示意图,返回,大分子的核酸具有免疫原性。提取核酸的主要步骤：,核酸抗原制备,破碎细胞,核酸从细胞中游离出来,酸沉淀核,除去蛋白质,乙醇,酚和氯仿,类脂多糖抗原制备,苯酚法提取,LPS,：,干燥菌体或湿菌体,水中,混匀,激烈搅匀,加热,5min,冰水,急冷,降至,10,以下,离心,上层的水层,(,含,LPS),下层的酚层,菌体残渣于底部,吸取,水层,透析,除酚,加热,超速离心,浓缩,LPS,在上层沉淀的透明胶状部内,绞出,悬于水中,离心,得纯化,LPS,类脂多糖抗原制备,同温的苯酚,1,酶裂解法,酶对免疫球蛋白的水解有极好,的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解,为不同的片段。,2,氧化法和还原法,是将免疫球蛋白轻、重,链分开的两种常用方法。,3.,还可用强变性剂或利用改变,pH,将免疫球蛋,白亚单位分开。,免疫球蛋白片段制备,酶水解免疫球蛋白示意图,Fc,段，用以制备抗重链血清,F(ab,),2,，常作为抗体试剂用于试验,木瓜蛋白酶,（,papain,),胰蛋白酶,(pepsin),胃蛋白酶,(pepsin),纯化抗原的鉴定,(,四,),纯化抗原的鉴定,1.,含量鉴定,2.,分子量鉴定,凝胶层析技术进行测定,聚丙烯酰胺凝胶电泳,凝胶管状电泳,超速离心,3.,纯度鉴定：,免疫电泳，醋酸纤维膜电泳,4.,免疫活性鉴定：,常用双向琼脂扩散试验,三、人工抗原的制备,人工抗原：是指经过人工修饰后具有免疫原性的半抗原。如：低分子量的化学物质。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、某些药物,(,包括抗生素）及其他化学物品等。,(,一,),载体的选择,1.,蛋白质：人血清白蛋白、,牛血清白蛋白,、兔,血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。,2.,多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖,氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万,),，这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动物产生高效价、高亲和力的抗体。,3.,大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮,等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦,可诱发动物产生抗体。,(,二,),半抗原与载体的连接,碳化二亚胺法：,R-NH=CH-R,半抗原载体蛋白质,搅拌,1,2h,室温,24,h,透吸除去未反应的半抗原,人工免疫原,半抗原载体连接方法1,混合,混合,戊二醛法,:,半抗原,-NH,2,载体蛋白,-NH,2,半抗原,-N=,CH-(CH,2,),3,-CH=,NH-,载体蛋白,OHC-(CH,2,),3,-CHO,*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双,功能联接剂,半抗原载体连接方法2,氯甲酸异丁脂法：,半抗原,-COOH,载体蛋白,-NH,2,Cl-COO-CH,2,CH(CH,3,),2,半抗原,-COO-COO-CH,2,CH(CH,3,),2,半抗原,-CO-,NH,-,载体蛋白,半抗原载体连接方法3,简便，用于类固醇抗原制备,HO-,CH,2,CH(CH,3,),2,琥珀酸酐法：,用于不含羧基衍生物半抗原制备,半抗原,-CH,2,OH,CH,2,-CO,CH,2,-CO,带羧基的半抗原琥珀酸衍生物,半抗原,-CH,2,-OOC-CH,2,-CH,2,-COOH,返回,吡啶,再经氯甲酸异丁脂法或碳化,二亚胺法制备载体半抗原,半抗原载体连接方法4,*一、概念：,与抗原同时或预先注射于机体，能增加机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。,条件：,增加抗原的表面积；,改变抗原的活性基团构型；,佐剂与抗原混合能延长抗原在局部,组织的存留时间；,可直接或间接激活免疫活性细胞；,无毒性或无副作用。,四、佐剂,1.,氢氧化铝佐剂：,5%,硫酸铝,5%,氢氧化钠,氢氧化铝沉淀,制成悬液,即为佐剂,强烈搅拌,NS,洗,二次,NS,等体积抗原,免疫接种,二、常用佐剂的种类和制备,10%,硫酸钾铝,氢氧化钠校正,pH,值至,6.5,沉淀,乳状悬液,*,明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射,易引起肉芽种和脓肿。,NS,搅拌,NS,洗,二次,离心,抗原,备用,防腐剂,作用大于不完全佐剂,局部形成肉芽种和溃疡,不能用于人体,弗氏完全佐剂,三,.,弗氏佐剂,(Freund adjuvant),液体石蜡,完全乳化,备用,高压,灭菌,加热,抗原,弗氏不完全佐剂,卡介苗,羊毛脂,鉴定,一滴,乳剂,乳剂不散浮于液面,水中,混合,目的,:,增强抗原对机体的免疫原性；,增强抗体的产生能力；,为制备出高效价的免疫血清；,增强可溶性抗原的免疫原性；,在某种情况下，要改变抗原免疫应答类型；,延长抗原在免疫动物的时间；,改变抗原的分布；,增强局部对变应原的超敏反情况；,四,.,佐剂的应用原则和评价,佐剂常混有微量其它物质，这些物质进,入体内后也可引起抗体的产主，影响抗,血清的特异性；,注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌,性脓肿；,反复注射，易发生超敏反应，使局部组,织坏死，甚至引起动物死亡。,五,.,应用佐剂的缺点,.,免疫血清的制备,一,.,选择免疫动物,二,.,免疫方法,三,.,动物采血法,四,.,免疫血清的纯化,五,.,抗血清的鉴定与保存,能作为免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。,兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。,(,一,).,抗原与动物种属关系：差异越远越好；,(,二,).,动物的个体状况：适龄、健壮、正常、体重合乎要求；,(,三,).,抗原的性质：不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫应答；,(,四,).,按免疫血清用量和要求：选择不同物。,一,.,选择免疫动物,(,一,).,免疫原的注射剂量,(,二,).,免疫间隔时间：首次与二次尤为重要，整免疫过程,5,至,8,次。,(,三,).,免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌,二,.,免疫方法,1.,颈动脉放血法：羊、兔最常用的方法,2.,静脉采血法,：羊、兔，小鼠断尾或眼球,3.,心脏采血法：操作熟练如兔、豚鼠、鸡,三,.,动物采血法,四、免疫血清的纯化,(,一,),特异性抗体的纯化,1.,亲合层析法：将交叉抗原交联到,Sepharose,4B,上，装柱，将预吸收抗体通过亲合层析柱，杂抗体吸在柱上，流出液是特异性抗体。,2.,吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直,接加到免疫血清中，杂抗原则与杂抗体结合，上清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。,五、抗血清的鉴定与保存,(,一,).,抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定,(,二,).,抗体特异性鉴定：,细菌类抗原的抗体用凝集试验,可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验,(,三,).,抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法,(,四,).,抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好,(,五,),抗血清的保存,1.4,保存：可保存,3,6,个月,2.,低温保存：,-20,-40,可保存,2,3,年,3.,冰冻干燥保存：可保存,3,5,年,第二节 免疫学检测,免疫凝集试验,免疫沉淀试验,与补体相关的试验,酶联免疫试验,荧光免疫技术,免疫电镜技术,一、免疫凝集试验,凝集反应是指,颗粒性抗原,如细菌、细胞等与相应抗体在电解质存在条件下的结合，出现肉眼可见的凝集现象。细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。,（一）直接凝集试验（,direct agglutination,）,玻片法,定性多,试管凝集法,定量多,颗粒性抗原抗体,凝集,可溶性抗原相应抗体 不凝集,可溶性抗原,无关载体抗体 凝集,常用载体,RBC,聚苯乙烯乳胶,活性碳,胶体金,A.,无菌生理盐水,B.,抗原,(,颗粒抗原,)C.,抗体,（二）间接凝集试验（,indirect agglutination,）,将,已知可溶性抗原,吸附于或耦联于一种与免疫无关的载体表面，形成致敏颗粒，再与相应抗体作用而出现的凝集现象称为间接凝集试验，也称为被动凝集试验。常用于吸附抗原的载体颗粒有动物的红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭等。吸附抗原的颗粒称为致敏颗粒。该法十分敏感，可用已知可溶性抗原致敏的载体颗粒检测微量存在的相应抗体。,（三）间接血凝试验（,indirect,hemagglutination,）,间接血凝试验是将抗原（或抗体）包被于红细胞表面，成为致敏载体，再与相应的抗体（或抗原）结合，出现可见的血凝现象，也称为被动血凝试验。,红细胞包被上抗原，用以检测抗体的血凝试验称为,正向间接血凝试验,（,PHA Passive,Hemagglutination,Test,）,红细胞包被上抗体，用以检测抗原的血凝试验称为,反向间接血凝试验,（,RPHA Reverse passive,Hemagglutination,Test,）。,如果先将可溶性抗原（或抗体）与相应的抗体（或抗原）混合，再加入用抗原或抗体致敏的红细胞，则能抑制原先的血凝现象，称为正向（或反向）间接血凝抑制试验。,（四）协同凝集试验（,Co-agglutination,）,金色葡萄球菌细胞壁中的蛋白质成份,A,（,SPA,）能与人和多种哺乳动物血清的,IgG,类抗体的,Fc,段结合，成为致敏颗粒。特异性,IgG,的,Fc,段与,SPA,结合后，其,F(ab)2,段暴露在葡萄球菌菌体表面，仍保持抗体活性，当与相应的抗原反应时，可借助特异性抗体,F(ab)2,段与相应抗原互相连结而呈现凝集现象。在该种凝集反应中，金色葡萄球菌成为,IgG,的载体，故称协同凝集试验。国际上通用的菌株为金色葡萄球菌,Cowan,株（,NCTC-8530,），国内已引进，由卫生部药品生物制品检定所编号为,2611,。不含,SPA,的对照株为,Wood 46,株。,四、免疫沉淀试验,沉淀反应是指,可溶性抗原,（细菌培养滤液、细胞或组织的浸出液、血清蛋白等）与相应抗体在液相中特异结合后，形成的免疫复合物受电解质影响出现的沉淀现象。,反应中的抗原称为,沉淀原,（,precipitinogen,），可以是类脂、多糖或蛋白质等；抗体称为,沉淀素,（,precipitin,）。,液相沉淀反应,（,fluid phase precipitation,）,环状沉淀（,ring precipitation,）,絮状沉淀（,flocculation,）,免疫浊度测定（,immuno-turbidimetry,）,。,凝胶扩散试验,（,gel diffusion,）,单向琼脂扩散（,single diffusion,）,双向琼脂扩散（,double diffusion,）,凝胶免疫电泳,（,gel,immunoelectrophoresis,）,（一）环状沉淀试验,将已知的抗血清加入到小口径试管的底部，然后将已适当稀释的待检抗原溶液小心地加在抗血清的表面，使两种液体成为分界面清晰的两层。,室温下静置数分钟，若抗原与抗体相对应，则在液面交界处出现白色环状沉淀，即为阳性反应。,本法主要用于抗原的定性试验，如鉴别血迹性质、细菌血清型鉴定和沉淀素的效价滴定等。试验时出现白色沉淀环的最高抗原稀释倍数即为该抗血清的沉淀价。,（二）絮状沉淀试验,可溶性抗原与相应抗血清在试管内或凹玻片上混合，出现肉眼可见的混浊沉淀或絮状沉淀，即为阳性反应。当抗原抗体比例最适时，沉淀物出现最快，混浊度最大；当抗原过剩或抗体过剩时，出现后带或前带现象。,通常用固定抗体稀释抗原法（,操作法）或固定抗原稀释抗体法（,操作法），以检测抗原或抗体的最适比例。本法敏感性不高，在疾病诊断上的应用日趋减少。,（三）免疫浊度法,可溶性抗原和抗体在液相中特异性结合，形成一定大小的抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。,当反应液中固定抗体或抗原的浓度，在一定线性范围内，反应液的浊度会随着抗原或抗体量的增加而呈正比例增大，与一系列的标准品对照，就可计算出样品中的抗原或抗体的量。,免疫浊度法可分为免疫散射比浊法和免疫透射比浊法两种。,前者需用专门的浊度计，测定的是单纯散射光，后者可用分光光度计（或比色计）和其它自动分析仪，测定的是溶液吸光度。,本法与双向单扩散法有高度的一致性，且敏感性高，操作简单快速，不足之处在于抗血清用量略多于扩散法。,（四）免疫扩散（,immunodiffusion,）,1,、单向琼脂扩散,2,、火箭电泳单向琼脂扩散电场,3,、双向琼脂扩散,4,、对流免疫电泳双向琼脂扩散电泳,1,、单向琼脂扩散,2,、火箭电泳单向琼脂扩散电场,一、原理,抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比，用标本中的抗原含量。,火箭电泳操作时应注意以下几点：,1,所用琼脂可选择无电渗或电渗很小的，否则火箭形状不规则。,2,注意电泳终点时间，如火箭电泳顶部呈不清晰的云雾状或圆形皆提示未达终点。,3,标本数量多时，电泳板应先置电泳槽上，搭桥并开启电源（电流要小）后再加样。否则易形成宽底峰形，使定量不准。,4,作,IgG,定量时，由于抗原和抗体的性质相同，火箭峰因电渗呈纺缍状。为了纠正这种现象，可用甲醛与,IgG,上的氨基结合（甲酰化），使本来带两性电荷的,IgG,变为只带电荷，加快了电泳速度，抵消了电渗作用，而出现伸向阳极的火箭峰。,3,、双向琼脂扩散,抗原、抗体在凝胶中扩散，并进行沉淀反应，叫做免疫扩散反应（,immunodiffusion,）。将抗原与其相应抗体放在凝胶（如琼脂）平板中的邻近孔内，使它们互相扩散，当扩散到两者浓度比例合适的部位相遇时，即出现乳白色的沉淀线，称为双向免疫扩散试验。此方法是由,Ouchterlony,所提出，因此又称,Ouchter-lony,技术。,双向免疫扩散试验非但可对抗原或抗体进行定性鉴定和测定效价，还可对抗原或抗体进行纯度分析和同时对两种不同来源的抗原或抗体进行比较，分析其所含成分的异同。,若在两孔内有两对或两对以上的抗原抗体系统，就能产生相应数量的分离的沉淀线。因此，利用此法可进行抗原或抗体的纯度分析。,沉淀线形成的位置与抗原、抗体浓度有关，抗原浓度越浓，形成的沉淀线距离抗原孔越远，抗体浓度越浓，形成的沉淀线距抗体孔越远，因此，当固定抗体的浓度，稀释抗原，可根据已知浓度的抗原沉淀线的位置，测定未知抗原的浓度；反之固定抗原的浓度，亦可测定抗体的效价。,此外观察两个邻近孔的抗原与抗体所形成的两条线是交叉抑或相连，可用来判断该两抗原是否有共同成分。假如同样的纯抗原,a,放在两个邻近的孔中，对应抗体放在中央孔中，两条沉淀线在其相邻的末端会互相连接和融合；若两个不同的抗原,a,和,b,，则两线互相交叉；若两个抗原有部分相同成分,a,和,ab,，则两线除有相连部分以外还有一伸出部分。,4,、对流免疫电泳双向琼脂扩散电泳,对流电泳（,counterimmunoelectrophoresis,）是一敏感快速的检测方法，即在电场作用下的双向免疫扩散。将琼脂板放入电泳槽内，使琼脂板的两孔沿着电场的方向，于负极侧的孔内加入抗原，于正极侧的孔内加入抗体，通电后，抗原在碱性缓冲液,(pH8.2),中带负电荷向正极泳动，抗体分子虽也带负电荷，但因分子量大，且在其等电点附近，向正极的位移小，而受琼脂中电渗作用向负极移动，抗原和抗体能较快地集中在两孔之间的琼脂中形成免疫复合物的沉淀线。只需,1,小时左右即可观察结果。,五、与补体相关的试验,补体（,complement,，,C,）是存在于脊椎动物血清和组织液中一组具有酶原活性的蛋白质。,补体性质不稳定，室温下很快失活，,0,10,下,3,4d,失活。经,56,作用,30min,即失活。在生理状态下，血清中补体大多以无活性的酶前体形式存在。当它们被某些物质激活后，可发生连锁的酶促反应，表现出各种生物学活性如溶菌杀菌、细胞毒、调理吞噬、免疫吸附、中和溶解病毒和炎性介质等作用。涉及补体的实验方法大致分为两大类，一类为直接对补体活性和各组分含量的测定；另一类为有补体参与，用已知抗体（或抗原）检测相应抗原（或抗体）的实验。,（一）溶解试验,含有抗原的靶细胞与相应抗体结合后，如为无核细胞（如红细胞）则被溶解，如果是有核细胞（如肿瘤细胞）则被杀伤，而少数细菌可被溶解，多数细菌则被杀伤而失去活性。,1,溶血试验（,hemolysis,test,）,红细胞（如绵羊红细胞）与相应抗体结合后，在有补体存在时，红细胞被溶解，称为溶血试验。参加反应的抗体称为溶血素。,2,被动溶血试验（,passive,hemolysis,test,）,红细胞吸附抗原后，在相应抗体和补体存在下，出现红细胞溶解反应，称之为被动溶血试验。本方法与直接溶血试验的主要区别在于红细胞与抗原孵育后，红细胞吸附了抗原而被致敏，其它与溶血试验相同。,3,溶菌试验（,Bacteriolysis,test,）,革兰氏阴性菌在相应抗体和补体作用下，可引起菌体的溶解死亡，这与溶菌酶的溶菌反应有区别，故将由抗体和补体引起的溶菌反应称为,免疫溶菌反应,。实际上，这种免疫溶菌反应通常以细菌是否受到损伤、繁殖是否受到抑制、菌数（菌落）是否减少作为指标。有时将试管内的溶菌反应称为,杀菌反应（,bacteiocidal,reaction,）。,（二）补体结合试验（,complement fixation test,CFT,）,补体结合试验是利用抗原抗体复合物可与补体结合，而单独的抗原或抗体不能结合补体的特点，以溶血系统为指示剂，用已知抗原（或抗体）来检测未知抗体（或抗原）。,CFT,包括两种系统，分两个阶段进行。,第一系统为待检系统：抗原,+,抗体,+,补体。如果抗原与抗体相对应，则能特异性结合并固定补体；否则，补体不被结合，仍游离于溶液中。,第二系统为指示系统：绵羊红细胞,+,溶血素，作为第一系统抗原与抗体是否相对的指示剂。如果第一系统中抗原与抗体特异性结合，固定了补体，则再加入绵羊红细胞与溶血素时，由于缺乏补体，不会发生溶血反应，此为,CFT,阳性。若抗原与抗体不相对应，则补体不被结合，仍游离于溶液中，而被随后加入的绵羊红细胞与溶血素复合物固定、激活，导致红细胞溶解，此为,CFT,阴性。,六、酶联免疫试验,酶联免疫试验是利用抗原抗体反应的高度特异性和酶促反应的高度敏感性，进行对抗原或抗体的检测，是一种定性和定量的综合性技术。,直接法、间接法、双抗体夹心法和抗原竞争法。,敏感性,化学比色法的敏感度为,mg/ml,水平,酶反应测定法的敏感度约为,5-10g/ml,免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿,标记的免疫敏感度可提高数千倍，达,ng,/ml,水平,（一）直接法,(,二,),间接法,（三）双抗体夹心法,（四）竞争法,（五）,ELISA,的试剂,(A,、,B,、,C,三部分,),ELISA,中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。,（,1,）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；,（,2,）酶标记的抗原或抗体（结合物）；,（,3,）酶的底物；,（,4,）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；,（,5,）结合物及标本的稀释液；,（,6,）洗涤液；,（,7,）酶反应终止液,试剂准备,A.,免疫吸附：包被的方式,将抗原或抗体固定在过程称为包被,(coating),。,蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。,包被的条件,pH9.6,碳酸盐缓冲液,pH7.2,的磷酸盐缓冲液,pH7-8,的,Tris,-HCL,缓冲液。,加入包被液后，在,4-8,冰箱中放置过夜，,37,中保温,2,小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为,10ng/ml-20ug/ml,。,封闭,封闭,(blocking),是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥,ELISA,后的步骤中干扰物质的再吸附。,常用封闭剂：,0.05%-0.5%,的,BSA;10%,的小牛血清或,1%,明胶,;,脱脂奶粉,比较价廉，可以高浓度使用（,5%,）。,所有的,ELISA,固相均需封闭？,洗涤液,在板式,ELISA,中，常用的稀释液为含,0.05%,吐温,20,磷酸盐缓冲液。,ELISA,的试剂准备,B,1,、结合物,即酶标记的抗体（或抗原）是,ELISA,中关键的试剂,1,酶的催化活性,2,抗体（或抗原）的免疫活性,3,含有或少含有游离的抗体（或抗原）,4,结合物尚要有良好的稳定性。,酶,纯度高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。,酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。,在,ELISA,中，,HRP,，,AP,，,葡萄糖氧化酶，,-D-,半乳糖苷酶和脲酶等。,试剂准备,C,酶的底物,HRP,的底物,OPD,氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在,492nm,处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是,HRP,结合物最常用的底物。,DH,2,+H,2,O,2,D+2H,2,O,上式中，,DH,2,为供氧体，,H,2,O,2,为受氢体。,DH,2,一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。,DH,2,如：邻苯二胺,(OPD),、,四甲基联苯胺,(TMB),和,ABTS,。,TMB,经,HRP,作用后共产物显蓝色。,TMB,性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与,H,2,O,2,溶液混和即成应用液。酶反应终止后，,TMB,产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为,450nm,。,ABTS,虽不如,OPD,和,TMB,敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。,HRP,对氢受体的专一性很高，仅作用于,H2O2,、,小分醇的过氧化物和尿素过氧化物,(urea peroxide),。,AP,的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯,(,pNPP,),作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在,405nm,波长处有吸收峰。用,NaOH,终止酶反应后，黄色可稳定一时间。,AP,也有发荧光底物（磷酸,4-,甲基伞酮），可用于,ELISA,作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。,酶反应终止液,常用的,HRP,反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式,ELISA,中一般采用,2mol/L,。,（六）对照设定,阳性对照品,(positive control),和阴性对照品,(negative control),是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。,阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。,加入的量应与试剂的敏感度相称；,在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。,加样,:,在,ELISA,中一般有,3,次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在,LEISA,板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,（七）基本操作注意事项,保温,抗原抗体完成反应的保温过程称为温育,(incubation),。,ELISA,属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么,ELISA,反应总是需要一定时间的温育？,温育常采用的温度有,43,、,37,、室温和,4,（冰箱温度）等。,37,是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。,保温方式：,ELISA,仪器附有特制的电热块，水浴。,若用保温箱：,ELISA,板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将,ELISA,板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。,室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指,20-25,，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。,洗涤,洗涤在,ELISA,过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。,ELSIA,洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。,清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。,聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。,可以说在,ELISA,操作中，洗涤是最主要的关键技术。,洗涤的方式除某些,ELISA,仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有,流水冲洗式和,浸泡式两种：,（,1,）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。,（,2,）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为,非离子型洗涤剂,的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。,显色,显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。,TMB,受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。,TMB,经,HRP,作用后，约,40,分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至,2,小时后即可完全消退至无色。,比色,拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。,以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。,结果以光密度（,oplical,density,，,OD,），,现按规定用吸光度（,absorbence,，,A,），,两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于,A,字母的右下角，如,OPD,的吸收波长为,492nm,，,表示方法为,A,492,nm,或,OD,492,nm,。,（八）结果判断,6.1,定性测定,A.,阳性判定值：,（,cut-off value,）,一般为阴性对照,A,值加上一个特定的常数,(0.05),，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。,B.,标本,/,阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较为合适。在得出标本（,S,）,和阴性对照（,N,）的,A,值后，计算,S/N,值。,间接法和夹心法,（,2,）竞争法,因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出,S,、,P,和,N,的吸光值。,a.,阳性判定值法,阳性判定值,=0.4,NCX+0.6,PCX,阳性,A,阳性判定值,阴性,A,阳性判定值,b.,抑制率法,抑制率（,%,）,=,（阴性对照,A,值,-,标本,A,值）,100%/,阴性对照,阳性 抑制率,50%,阴性 ,50%,七、荧光免疫技术,（一）原理,荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态而极不稳定，其迅速回到基态时，以电磁辐射形式释放出所有的光能，发射出波长较照射光长的荧光。,八、免疫电镜技术,（一）铁蛋白抗体法,铁蛋白是从组织（主要是肝脏和脾脏）中提取的一种含铁蛋白，铁蛋白可通过双功能试剂如二异氰酸间二甲苯、二异氰酸甲苯和二氟,-,二硝基苯砜等与抗体结合。抗体与抗原反应后，在电镜下结合铁蛋白的抗体部位呈黑色，因而能极精确地显示出抗原所在部位。铁蛋白抗体法在细胞膜表面抗原标记研究中广泛应用，既可用于透视电镜、扫描电镜，也可用于冷冻蚀刻复型。,（二）酶标记抗体法,在免疫电镜中，用于标记的酶主要有辣根过氧化物酶（,HRP,），因为其具有稳定性强、反应特异性高和分子量小、易于穿透组织和细胞等优点。组织标本经甲醛溶液固定后，漂洗去除甲醛溶液，再切成厚,20m,的薄片，即可用酶标记抗体或其它间接染色法处理，反应显色后，按常规电镜脱水、包埋、切片、染色和观察。在电镜下，本法不如铁蛋白抗体法清晰。,（三）重金属标记抗体法,除铁蛋白抗体和酶标记抗体法外，还有重金属标记抗体法。由于在超微结构水平上研究抗原抗体反应的标记物如铁蛋白和,HRP,分子量较大，不是较理想的标记物，而醋酸铀的分子量较小，且铀原子具有电子致密性，能非特异性地结合在整个抗体分子上，故醋酸铀是一种较好的电镜标记物。用醋酸铀标记抗体时，必需先将抗原与抗体结合以保护抗体的特异性结合部位，再用铀原子标记抗体后，将抗原抗体分开，除去抗原成分，即得未失去免疫反应性的铀标记抗体。,另一种可标记抗体的重金属是胶体金。胶体金在碱性条件下带负电荷，与抗体相吸附，从而将抗体标记。吸附胶体金的抗体可离心沉淀。,5nm,以上的胶体金颗粒也存在对组织细胞穿透力差的缺点，故主要用标记细胞膜表面抗原，而,1nm,胶体金颗粒和银增强染色的出现，极大地推动了胶体金标记技术在包埋前免疫染色中的应用。免疫胶体金法可分为直接法、间接法、金标记抗原检查法和链霉抗生物素,金法，最常用的是间接法,第三节,PCR,技术,一、,PCR,原理,多聚酶链式反应（,polymerase chain reaction,PCR,）简称,PCR,技术，是在模板,DNA,、引物和,4,种脱氧核糖核苷酸存在的条件下依赖于,DNA,聚合酶的酶促反应。,PCR,技术的特异性取决于引物和模板,DNA,结合的特异性。,反应分三步进行：变性（,denaturation,）：通过加热使,DNA,双螺旋的氢键断裂形成单链,DNA,；,退火（,annealling,）：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物量大大多于模板,DNA,，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板,DNA,双链之间互补的机会较少；,延伸（,extension,）：在,DNA,聚合酶和,4,种脱氧核糖核苷三磷酸底物及,Mg,2+,存在条件下，,53,的聚合酶催化以引物为起始点的,DNA,链延伸反应。以上,3,步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模板，数小时之后，介于两个引物之间的特异性,DNA,片段得到大量复制，数量可达到,210,6-7,拷贝。,经过变性、退火和延伸一个循环，目的,DNA,数增加一倍，经过,n,次循环后，目的,DNA,的数量为,2n-2n,。,PCR,扩增的特异性是由人工合成的一对寡核苷酸引物所决定。在反应的初始阶段，原来的,DNA,担负着起始模板的作用，随着循规蹈矩环次数的增加，由引物介导延伸的片段急剧增加而成为主要模板。因此，绝大多数扩增产物将受到所加引物,5,末端的限制，最终扩增产物是介于两种引物,5,之间的,DNA,片段。,图,6-5 PCR,原理示意图,二、,PCR,条件的优化,（一）,PCR,反应的缓冲液,PCR,反应中，缓冲液是一个重要的影响因素，特别是其中的,Mg,2+,能影响反应的特异性和