课题3-血红蛋白的提取和分离-(2).pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,复习课：血红蛋白的提取和分离,课题目标,1.,说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法；,2,.说明凝胶色谱法的原理和方法；,3,.说出电泳的基本原理和方法；,4,.运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。,一、基础知识,（一）蛋白质提取与分离的依据,蛋白质的物理化学性质差异,1.,分子的形状、大小,2.,电荷性质和多少,3.,溶解度,4.,吸附性质,5.,对其他分子亲和力,（二）方法及原理,方法,原理,凝胶色谱法,电泳法,根据,相对分子质量,的大小分离蛋白质,根据分子,带电性质,的差异以及分子本身大小、形状的不同分离蛋白质,1.,凝胶色谱法,（,1,）材料：,凝胶,微小的多孔性球体,，如,葡聚糖或琼脂糖,。内部有许多贯穿的,通道,。,（,2,）原理：,小蛋白质,大蛋白质,混合物,上柱,洗,脱,大分子流动快,小分子流动慢,收集,大分子,收集,小分子,2.,缓冲溶液,(3),配制：,通常由,1,2,种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同,pH,范围内使用的缓冲液。,(1),概念：,在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液,pH,发生明显变化的溶液。,(2),作用：,能够抵制外界的酸或碱的对溶液的,pH,的影响，维持,pH,基本不变。,(4),本实验使用的是磷酸缓冲液,(,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,),目的是利用缓冲液模拟细胞内的,pH,环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（,红色,）和科学研究（,活性,）。,由,弱酸,和相应的,强碱弱酸盐,溶解于,水,中。如,H,2,CO,3,/NaHCO,3,，,NaH,2,PO,4,/Na,2,HPO,4,等。,3.,电泳法,（,1,）概念：,指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,（,2,）原理：,分离样品中各种分子,带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，,从而实现样品中各种分子的分离。,（,3,）类型：,琼脂糖凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶电泳,由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带,电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同,在凝胶中加入,SDS,，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质,SDS,复合物，使其迁移速度,完全取决于分子的大小,二、实验操作,血液组成成分,1.,洗涤,红细胞,2.,释放,血红蛋白,3.,分离,血红蛋白,4.,透析,血红蛋白,样品处理,和粗分离,纯化,纯度鉴定,血液,血浆,水 分,固体物质：,血浆蛋白、,无机盐、磷脂、葡萄糖等,血细,胞,白细胞,血小板,红细胞,（最多）,血红蛋白,（90）,两个,肽链,两个一肽链,四个亚铁血红素基团,2.问题：,血液有哪些成分？,1.问题：,用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,血红蛋白,两个,肽链,两个一肽链,四个亚铁,血,红素基团,每个肽链环绕一个,亚铁血红素基团，,此基团可携带,一分子氧或一分子二,氧化碳，,血红蛋白因含有,血红素,而,呈,红色。,血红蛋白的特点：,1.,洗涤红细胞,血液,100mL,3g,柠檬酸钠,低速离心,2 min,红细胞,血 浆,吸出血浆,红细胞,5,倍体积生理盐水,搅拌,10min,重复洗涤,3,次，,直至上清液没有黄色,（一）样品处理,2.,释放血红蛋白,洗涤好的红细胞导入烧杯,加蒸馏水到原血样体积,加,40,体积苯,充分搅拌,10,分钟,3.,分离血红蛋白,红细胞,混合液,高速离心,10min,离心管,滤纸,过滤,脂类物质,有机溶剂,血红蛋白,烧杯,(4),透 析：,过程：,取,1ml,的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有,300ml,的物质的量浓度为,20mmol/l,的,磷酸缓冲液,中（,pH,为,7.0,），透析,12,小时。,目的：,除去样品中分子量较小的杂质。,（二）凝胶色谱操作,1.,凝胶色谱柱的制作,2.,凝胶色谱柱的装填,3.,样品的加入和洗脱,1.,凝胶色谱柱的制作,打孔挖穴安管覆网纱包插管,2.,凝胶色谱柱的装填,50cm,高,固定色谱柱配凝胶悬液装填色谱柱洗涤平衡,沸水浴加热,紧密,不得有气泡,磷酸缓冲液,(pH,为,7.0,）,3.,样品的加入和洗脱,1.调液面,2.加样,3.再调液面,4.洗脱,5.收集,缓冲液,凝胶,红色区带均匀一致地移动。,三、操作提示,1.,红细胞的洗涤：,洗涤次数不能过少；低速、短时离心。,2.色谱柱的装填：,装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。,3,.,凝胶的预处理,：,沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡。,4.,色谱柱成功标志：,四、结果分析与评价,1.,血液样品的处理,分层明显样品处理完成,2.,凝胶色谱柱的装填,放一支与凝胶柱垂直的日光灯直接检查加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖,2000,或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整装填成功。,3.,血红蛋白的分离,血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出，分离成功。,血红蛋白的提取和分离,蛋白质分子的差异性,凝胶色谱法,原 理,分离过程,凝胶电泳法,缓冲溶液,组 成,作 用,蛋白质的,提取分离,样品处理,粗 分 离,纯 化,纯度鉴定,【,课堂小结,】,下列关于,DNA,粗提取实验和血红蛋白的提取实验,叙述正确的是,(,),A.,前者选择鸡血细胞作为实验材料较好,后者选择哺乳动物成熟的红细胞作为实验材料较好,B.,样品预处理时,前者静置,1,天处理除去上清液,;,后者需要加入清水,反复低速短时间离心洗涤,至上清液无黄色,C.,在,DNA,粗提取实验中,往,2 mol/L,氯化钠溶液中加入蒸馏水析出,DNA,时,应该缓慢加入,直到出现黏稠物即止,D.,洗涤红细胞的目的是去除血浆中的葡萄糖、无机盐等,【,课堂练习,】,A,1.,提取血红蛋白的实验中,洗涤红细胞时,不能加清水,应该加入生理盐水,否则细胞会提早释放出血红蛋白与杂质混合,加大提取难度。,【,方法点拨,】,2.,洗涤红细胞的目的是去除杂质蛋白,以利于血红蛋白的分离和纯化。,