化学检测技术.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,化学检测技术,1,第一页，共40页。,一、糖类的化学检测,糖类包括多糖、双糖、单糖,单糖和某些双糖具有游离羰基,还原糖,多糖和蔗糖等无还原性,非还原糖,糖类化学检测主要是利用游离羰基的还原性质，与试剂（氧化剂）进行氧化还原反应而进行测定的。,非还原糖必须转化为还原糖再进行测定,2,第二页，共40页。,最常用的试剂：,斐林（,Fehling,）试剂,基本组成：,A,：,CuSO,4,溶液,B:NaOH,和酒石酸钾钠溶液,使用时,A,、,B,等体积混合,(,生成酒石酸钾钠铜）,酒石酸钾钠铜是氧化剂，可与还原糖的游离羰基发生氧化还原反应，而进行糖的测定,。,3,第三页，共40页。,定糖常用方法,1,、,兰,爱农,（,Lane-Eynon,）法,次甲基蓝（亚甲基蓝、四甲基蓝）法、,（置换法、直接滴定法）,反应终点用,次甲基蓝指示剂,显示（还原糖滴定斐林试剂，由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量,1D,还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失）,多糖或其他非还原糖需转化为还原糖后再滴定如淀粉，可用酸解或酶解,4,第四页，共40页。,（1）福林酚试剂的配制,是双缩脲法的发展，灵敏高100倍，需时较长，而且对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更大，酚类和柠檬酸也有干扰。,次甲基蓝（亚甲基蓝、四甲基蓝）法、,注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘）,第三十五页，共40页。,第三十八页，共40页。,(4)样品滴定：以5mL样品液代替空白液，V1,（a）AB分开储存，防止Cu+变化，临用混合,次甲基蓝（亚甲基蓝、四甲基蓝）法、,A：CuSO4溶液,（1）碱性铜试剂双缩脲反应,（3）两种呈色反应可叠加,葡萄糖标准液（mL)0 1 2 3 4 5,将还原糖与二价铜离子反应生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。,（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘,（1）斐林试剂的标定,操作要点,（,1,）斐林试剂的标定,（,a,）标定预备试验,A,、,B,各,5mL,10mL,水（,250mL,三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，,2D1,次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（,0.1,或,0.2,）,V,1,mL,。,（,b,）标定,A,、,B,各,5mL,10mL,水（,250mL,三角瓶中）摇匀，从滴定管中预先加入（,V,1,-1)mL,标准葡萄糖液，摇匀后加热至沸腾，,2D1,次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在,1min,内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数,V,0,5,第五页，共40页。,(2),定糖,（,a,）定糖预备试验,A,、,B,各,5mL,10mL,样品糖液（,250mL,三角瓶中）摇匀，加热至沸腾，,2D1,次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失，耗标准葡萄糖液（,0.1,或,0.2,）,V,2,mL,。,（,b,）定糖,A,、,B,各,5mL,10mL,样品糖液（,250mL,三角瓶中）摇匀，补加（,V,0,-V,2,）,mL,水，并从滴定管中预先加入（,V,2,-1)mL,标准葡萄糖液，摇匀后加热加热至沸腾，,2D1,次甲基蓝溶液，用标准葡萄糖液滴定至蓝色消失（滴定在,1min,内完成），记录消耗标准葡萄糖液的总毫升数,V,。,6,第六页，共40页。,(3),计算,还原糖含量（以葡萄糖计）,（,V0-V)c (1/10)n,注意：,（,a,）,AB,分开储存，防止,Cu+,变化，临用混合,（,b,）单标移液管吸液准确，外壁也需擦干净,（,c,）体积需控制在一定范围内，对,pH,有影响,（,d,）煮沸时间要一致,（,e,）注意指示剂加入时间和加入量一致,（,f,）滴定速度一致（后滴定,0.5,1mL,，,1min,内完成）,（,g,）产物,Cu,2,O,不稳定，次甲基蓝变色也不稳定，暴露于空气或沸腾颜色变化，滴定过程不能摇动，不可中途中止加热,7,第七页，共40页。,斐林试剂快速法,：,在斐林试剂中加入,亚铁氰化钾（黄血盐）,反应终点为蓝色消失，淡黄色出现。反应终点比兰爱农法更为明显,。,8,第八页，共40页。,2,、碘量法,I,2,NaIO(,氧化剂）,其氧化能力较弱，仅适用于醛糖的测定，与酮糖不起反应,操作要点：,（,1,）标准硫代硫酸钠溶液配制，,0.05 mol/L,，沸腾后冷却水配制，存放在棕色瓶中，一周后用标准重铬酸钾标定。,（,2,）标准碘液配制，,0.1mol/L,（,3,）空白滴定：空白液，用硫代硫酸钠滴定试剂中全部碘,9,第九页，共40页。,碘量瓶中，,10mL0.1mol/L,碘液,15mL0.1 mol/LNaOH,5mL,空白液，摇匀后暗反应,15min,1mL1mol/L,硫酸溶液，用,0.05mol/L,硫代硫酸钠滴定至浅黄色，加,0.2mL0.5,淀粉液作指示剂，滴定至蓝色消失，记录,V,0,(4),样品滴定：以,5mL,样品液代替空白液，,V,1,(5),计算：,醛糖含量（,V,0,V,1,）,C M n,注意：暗反应后需酸化再滴定，滴定时开始轻摇（碘挥发），后再摇（淀粉吸附碘）,配合次甲基蓝法测定某些糖含量（如：果糖）,10,第十页，共40页。,3,、铜试剂法,将还原糖与二价铜离子反应生成的,Cu,2,O,用碘氧化，再用硫代硫酸钠滴定反应液中剩余的碘而测定样品还原糖的含量。,（,1,）铜试剂的配制,主要提供二价铜离子及碘,（,2,）标准曲线的制作,11,第十一页，共40页。,(a),标准葡萄糖液的配制,0.1%,或,0.05,（根据所用铜离子试剂定）,(b),三角瓶编号,1 2 3 4 5 6,葡萄糖标准液（,mL)0 1 2 3 4 5,蒸馏水（,mL)5 4 3 2 1 0,铜试剂（,mL)5 5 5 5 5 5,沸水浴,10min,，冷却至室温,(c),各加入,0.5mol/L,硫酸,5mL,，振荡，待红色,Cu,2,O,完全溶解后，用硫代硫酸钠滴定至终点，记录耗用量,V,(d),绘标准曲线,葡萄糖含量（,mg,）为纵坐标，（,V,0,-V),为横坐标,12,第十二页，共40页。,二、蛋白质和氨基酸的化学检测,蛋白质含氮量几乎恒定，平均,16,测出,N,含量,6.25,，即为蛋白质量,eg,：,含氮量 每克,N,相当蛋白质量,肉、蛋、豆,16,6.25,面粉,17.6,5.70,奶品,15.7,6.38,花生,18.2,5.50,鲑精蛋白,31.5,3.17,13,第十三页，共40页。,蛋白质常用检测方法,1,、,定氮法（经典的，仲裁的）,凯氏定氮法或微量凯氏定氮法,（,1,）原理,消化、蒸馏、吸收、滴定计算,（,2,）操作要点,(a),消化,：,目的：使样品中的蛋白质分解，其中氮与硫酸反应生成,(NH,4,),2,SO,4,凯氏定氮瓶，样品,K,2,SO,4,-CuSO,4,、浓,H,2,SO,4,通风厨内进行，消化液全部移入,100mL,容量瓶定容。,14,第十四页，共40页。,15,第十五页，共40页。,(b),蒸馏,：目的：碱化蒸馏使氨游离。,加,10,50ml,30%,氢氧化钠，防止漏气。,(c),吸收,：,5mL 2,H,3,BO,3,吸收或一定量标准酸溶液（如,25mL 0.05mol/L H,2,SO,4,),甲基红溴甲酚绿几滴,(d),滴定计算,：,若,H,3,BO,3,吸收：,0.01mol/L Hcl,滴定至绿色 淡紫红色,样品中的总氮量（,mg)=,（,A-B)C14n,若标准硫酸接收：,0.1mol/L,标准,NaOH,滴定，甲基红黄色终点,样品中总氮量,=,（,C,1,V,1,-C,2,V,2,)14n,粗蛋白含量样品的总氮量,6.25,16,第十六页，共40页。,2,、双缩脲试剂法,蛋白质含有两个以上脲键，有双缩脲反应：,蛋白质（多肽）,CuSO,4,（,NaOH,）铜钠双缩脲络合物（紫红色络合物）,A,Cp,，与蛋白质的分子量和氨基酸组成无关,Tris,缓冲液干扰,P,的测定,，,测定范围,1,10 mg/mL,17,第十七页，共40页。,操作,：,（,1,）双缩脲试剂的配制,CuSO4,、酒石酸钾钠、,NaOH,、,0.1%KI,(2),标准曲线的制作,1,标准酪蛋白,(mL)0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0,蒸馏水,(mL)1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0,双缩脲试剂,(mL)4 4 4 4 4 4,室温反应,30min,测,A,540,(3),样品测定：,1mL,4mL,双缩脲试剂，,30min,，测,A,540,18,第十八页，共40页。,3,、福林酚试剂法,是双缩脲法的发展，灵敏高,100,倍，需时较长，而且对双缩脲反应有干扰的物质对其影响更大，酚类和柠檬酸也有干扰。,原理：,（,1,）碱性铜试剂,双缩脲反应,（,2,）稀释的苯酚试剂,与酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反应呈蓝色,（,3,）两种呈色反应可叠加,19,第十九页，共40页。,操作：,（,1,）福林酚试剂的配制,甲液：碱性铜试剂（,A,、,NaOH,、,NaCO,3,B,、,CuSO,4,和酒石酸钾钠,),乙液：稀释的苯酚试剂,（,2,）标准蛋白溶液配制,结晶牛血清蛋白溶于,0.9,NaCl,或用酪蛋白（凯氏定氮法测定含量）,（,3,）标准曲线制作,（,4,）样品测定,1mL,样品（含,P15,500,g,）,5mL,甲液，室温,10min,，乙液,0.5mL,，混匀，室温,30min,，测,A,500750,20,第二十页，共40页。,氨基酸含量测定方法,1,、茚三酮显色法,微酸性条件下，氨基酸茚三酮反应生成紫色化合物，亚氨基酸（脯氨酸和羟脯氨酸）茚三酮反应生成黄色化合物,。,蛋白质、多肽和氨基酸均可发生印三酮反应。,取,1mL,样品溶液（含氨基酸,0.1,50ug),加,1mL,缓冲液（,pH5.0,6.7,），再加,1mL,茚三酮显色液，,100,水浴,15min,，自来水冷却后，加入,3mL60,乙醇溶液，测定,OD,570,，脯氨酸或羟脯氨酸测,OD,440,21,第二十一页，共40页。,2,、甲醛滴定法,氨基酸是两性电解质，不能用一般酸碱指示剂通过氢氧化钠来测定,。,加甲醛生成羟甲基衍生物，可以用碱滴定,。,注意：需用过量中性甲醛,。,22,第二十二页，共40页。,三、核酸的化学检测,根据核酸所含的磷及戊糖的化学性质，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等进行检测,。,1,、,定磷法,（,1,）核酸的消化,（,2,）磷的测定,定磷试剂，,45,水浴,25min,，冷却至室温测,OD,650,无机磷标准液作标准曲线,（,3,）核酸含量的计算,一般,DNA,含磷,9.5,RNA,含磷,9.2,，,RNA,量（总磷量无机磷量）,10.9,DNA,量（总磷量无机磷量）,10.5,23,第二十三页，共40页。,2,、二苯胺法测定,DNA,含量,DNA,中的,2-,脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在,595nm,处有最大吸收峰。在,40,400 g,范围内，,OD595,与,DNA,浓度成正比。,（,1,）二苯胺试剂的配制,（,2,）标准曲线制作,（,3,）样品,DNA,含量测定,24,第二十四页，共40页。,3,、地衣酚法测定,RNA,含量,RNA,在浓盐酸和三氯化铁的存在下，与,3,，,5,二羟甲苯（地衣酚）反应，生成绿色物质。一定浓度范围内，,OD,670,与,RNA,浓度成正比。,所有戊糖均可进行此反应，注意干扰（如,DNA,）。,操作：,地衣酚试剂配制；标准曲线制作；样品,RNA,测定,25,第二十五页，共40页。,三、蛋白质的免疫化学检测,利用抗原与抗体之间特异的结合反应而对蛋白质进行定性定量分析技术。,一、,抗原,-,抗体反应,（,antigen-antibody reaction,）,是指抗原与相应抗体在体内或体外发生的特异性结合反应,。,反应的特点：,可逆性最适比例特异性敏感性,26,第二十六页，共40页。,（,1,）凝集反应,效价测定，细菌、病毒分类,（,2,）沉淀反应,沉淀反应、界面（环状）试验、免疫扩散、免疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光检测等,（,3,）免疫标记,二、蛋白质的免疫化学检测方法,27,第二十七页，共40页。,1,、凝集反应,凝集反应,（,agglutination,）,是指细菌、红细胞等,颗粒性,抗原与相应抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的凝聚物。其中参与反应的抗原称为,凝集原,，其抗体称为,凝集素,。,28,第二十八页，共40页。,直接凝集,：,细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现凝集现象。,间接凝集反应,：,将可溶性抗原包被在与免疫无关的载体颗粒表面，再与相应抗体反应出现颗粒物凝集现象,。,间接凝集抑制试验,：,将待测抗原与特异性抗体先行混合并作用一定时间，再加入相应致敏载体悬液。若待测抗原与抗体对应，即发生中和，随后加入的相应致敏载体颗粒不再被凝集，使本应出现的凝集现象被抑制。,29,第二十九页，共40页。,30,第三十页，共40页。,2,、沉淀反应,可溶性抗原,沉淀反应（,precipitation,）,:,可溶性,抗原与相应的抗体结合后，在一定条件下出现肉眼可见的沉淀。,包括：血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液、各种微生物蛋白分子等。,反应特点：比例性,包括：沉淀试验、界面试验、免疫扩散,（单向免疫扩散、双向免疫扩散）、免疫电泳、免疫亲和层析、免疫荧光,31,第三十一页，共40页。,沉淀试验,界面试验,32,第三十二页，共40页。,33,第三十三页，共40页。,3,、免疫标记,免疫标记技术,（,immunolabelling technique,）,用荧光素、酶、放射性核素或化学发光物质等标记抗体或抗原，进行抗原抗体反应的检测。,34,第三十四页，共40页。,常用的免疫标记物质：,荧光素,酶,放射性核素,金属颗粒,具体检测分为：,免疫荧光法、酶免疫测定、放射免疫测定法、化学发光免疫分析、免疫印迹法,35,第三十五页，共40页。,（,1,）免疫荧光法,免疫荧光法,（,immunofluorescence,IF,）,用,荧光素,与抗体连接成荧光素标记抗体，再与待测样品中的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发荧光，借此对抗原进行定性或定位,包括,：,直接荧光法、间接荧光法,36,第三十六页，共40页。,37,第三十七页，共40页。,38,第三十八页，共40页。,（,2,）酶免疫测定,酶免疫测定,（,enzyme immunoassay,）：,即将抗原,-,抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，借助于,酶,作用于底物的显色反应判定结果。可以通过酶标测定仪测定光密度（,OD,）值，反应抗原含量，达到定量分析的目的。,39,第三十九页，共40页。,（,3,）放射免疫测定法,放射免疫测定,（,radioimmunoassay,RIA,）,:,用,放射性核素,标记抗原或抗体进行免疫学检测。,该法灵敏度高特异性强，常用于测定微量物质。,40,第四十页，共40页。,