长期毒性作用及其试验方法课件.ppt

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周日,15,一、一般原则和要求,基本原则,整体性,长期毒性试验不能与药效学、药代动力性和其他毒理学研究割裂，试验设计应充分考虑其他药理毒理研究的试验设计和研究结果。长期毒性试验的结果应该力求与其他药理毒理试验结果互为印证、说明和补充。,2026/2/1 周日,16,一、一般原则和要求,总体,原则,选用两种实验动物,三个剂量,给药途径应与临床拟用途径相同,2026/2/1 周日,17,一、一般原则和要求,总体,原则,至少在两种动物体上进行,，,兼顾雌雄性别。,选用两种实验动物,2026/2/1 周日,18,一、一般原则和要求,总体,原则,三个剂量,剂量至少分为高、中、低三个档次,。,高剂量组应能充分反映药物的毒性,，,低剂量组不出现毒性反应。,同时设一溶剂,(,或赋,形,剂,),对照组或已知药物毒性对照组。,2026/2/1 周日,20,理想动物的标准：,对受试物的生物转化与人体相近；,对受试物敏感；,已有大量历史对照数据。,二、实验动物,2026/2/1 周日,21,我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。,1.,种类及品系,二、实验动物,2026/2/1 周日,23,我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。,1.,种类及品系,二、实验动物,一类新药：,Beagle,犬,二类新药：杂种狗,2026/2/1 周日,24,我国药政部门规定的基本原则是选用两种动物,一种为啮齿类，首选大白鼠；另一种为非啮齿类，首选狗。,1.,种类及品系,二、实验动物,在吸入给药时，猴是首先推荐的动物，因为它在呼吸系统的解剖学和生理学方面比其它动物更接近人类。,如研究计划生育用药，应选择猴或其他大动物。,2026/2/1 周日,27,Beagle,犬：原产英国，纯种小猎兔犬,Beagle,犬的特点：体型小,毛短,性情温和,亲人,抗病力强,缺点：价格昂贵,2026/2/1 周日,28,2.,起始月,(,周,),龄,一般选择较年轻的或正处于生长发育阶段的动物,。,二、实验动物,2026/2/1 周日,30,啮,齿类动物最好在断奶后不久即开始给药,大鼠,起始周龄,要求在,6,8,周龄,；,如果试验周期,超过,3,个月以上，则,将起始周龄降至,5,6,周龄,。,狗的起始月龄为,6,月龄,，,一般不超过,12,月 龄,；,如选用杂种狗,，,起始年龄可稍大些,，,但也不能超过,5,年。,二、实验动物,2.,起始月,(,周,),龄,2026/2/1 周日,31,起始体重应在体重均值,20%,的范围内,。,二、实验动物,2.,起始月,(,周,),龄,2026/2/1 周日,32,3.,性别及数量,（,1,）性别,二、实验动物,一般来讲是兼用两种性别的动物，每个剂量组中,雌雄性别的动物数必须一致。,2026/2/1 周日,33,在特殊情况下如药物对雄性（或雌性）生殖,细胞的毒效应已确知，或者急性试验已证明药物,对雌雄两性动物的毒性有明显差别时，就应主要,选用敏感性别的动物进行试验。,二、实验动物,3.,性别及数量,（,1,）性别,2026/2/1 周日,34,超过,90,天的试验,啮齿类动物每组至少,40,只（雌雄各,20,只）；,非啮齿类每组,810,只（雌雄各,45,只）。,90,天以内的试验,啮齿类动物每组至少,20,只（雌雄各,10,只）；,非啮齿类每组,46,只（雌雄各,23,只）；,二、实验动物,3.,性别及数量,（,2,）数量,2026/2/1 周日,35,超过,90,天的试验,啮齿类动物每组至少,40,只（雌雄各,20,只）；,非啮齿类每组,8-10,只（雌雄各,45,只）。,90,天以内的试验,啮齿类动物每组至少,20,只（雌雄各,10,只）；,非啮齿类每组,46,只（雌雄各,23,只）；,二、实验动物,3.,性别及数量,（,2,）数量,指导原则,：一般大鼠为雌、雄各,30,只，,Beagle,犬或猴各,36,只。,2026/2/1 周日,36,4.,饲养管理,严格控制环境条件，避免不必要的干扰因素是非常重要的。,二、实验动物,2026/2/1 周日,37,酮症酸中毒,室内温度,饲料或饲料配方,湿 度,光 照,通风条件,饮水质量,环境因素,4.,饲养管理,二、实验动物,2026/2/1 周日,38,酮症酸中毒,室内温度,饲料或饲料配方,湿 度,光 照,通风条件,饮水质量,环境因素,4.,饲养管理,二、实验动物,啮齿类动物,适宜温度为,1827,。,相对湿度为,40%70%,。,光照宜持续,12,小时明亮，,12,小时黑暗。,通风条件良好。,所用饲料应符合动物的营养标准。,雌雄动物应分开饲养，每笼不宜超过,5,只,2026/2/1 周日,39,酮症酸中毒,室内温度,饲料或饲料配方,湿 度,光 照,通风条件,饮水质量,环境因素,4.,饲养管理,二、实验动物,犬,单笼饲养，定量喂食。,Beagle,狗实验前至少驯养,12,周,;,杂种狗应先检疫，驱虫。,2026/2/1 周日,40,三、给药期限,按我国药政管理部门的要求，长期毒性试,验的给药期限一般为临床疗程的,34,倍时间。,创新药品试验周期应不少于,90,天，超过,180,天,的新药可以在试验开始,90,天后，同时进行,I,期临,床试验。,2026/2/1 周日,41,我国药政部门关于一般药物重复给药毒性试验期限的规定,临床拟用,毒性试验期限,给药时间,啮齿类动物,非啮齿类动物,5,天,2,周,2,周,2,周,1,月,1,月,2-4,周,3,月,3,月,1-3,月,6,月,6,月,3,月,6,月,9,月,每天给药最好固定时间。,2026/2/1 周日,42,四、剂量水平的选择,三个剂量组是必不可少的：,一个是足以引起明显的毒性反应的高剂量，但死亡率应控制在,20%,以内；,第二个是不引起毒性作用的低剂量,(,一般为动物有效剂量或临床治疗量的,23,倍,),；,为表明毒性作用的量,效关系，在上述两个剂量之间插入一个,(,或多个,),中间剂量。,中剂量按 计算,2026/2/1 周日,43,在选择合适的剂量时还应考虑到：,药物在体内的生物蓄积作用。对于高蓄积性药物应适当减少其剂量，否则在长期毒性试验结束时各剂量均有可能出现毒性作用；,药物是否有可能被特殊的酶所“解毒”或“活化增毒”，而这些酶又是否易被药物本身所诱导或抑制。,药物在消化道中的稳定性。与胃肠道内容物有亲和性的药物，则应酌情增加剂量。,可供参考的具体方法,（,1,）半数致死量法（,LD,50,法）,根据急性毒性的,LD,50,值决定三个剂量。一般在大鼠,3,个月长期毒性试验中，高、中、低三个剂量可分别采用约,LD,50,的,1/10,、,1/50,和,1/100,剂量，狗各剂量组可采用大鼠相应各组的一半剂量。,可供参考的具体方法,（,1,）半数致死量法（,LD,50,法）,（,2,）短期蓄积试验过渡法,根据急性毒性试验所提供的相关信息，如毒性的量,效关系，毒性出现的剂量范围及敏感动物等，先过渡到,7,天至,21,天的短期蓄积性试验，再将获得的参数外推于长期毒性试验。,急性毒性试验,蓄积毒性试验,和,/,或,7,天短期重复给药试验,90,天重复给药试验,180,天或更长期重复给药试验,可供参考的具体方法,（,1,）半数致死量法（,LD,50,法）,（,2,）短期蓄积试验过渡法,（,3,）药代动力学法,根据药代动力学最大有效安全浓度（,MCD,）,大鼠,3,个月长期毒性试验时，低、中、高三个剂量可分别采用大鼠的,1.0,、,3.36.6,和,1020 MCD;,狗一般可采用大鼠一半左右的剂量。,可供参考的具体方法,（,1,）半数致死量法（,LD,50,法）,（,2,）短期蓄积试验过渡法,（,3,）药代动力学法（,MBS,法）,根据大鼠急性毒性试验的最大耐受量,(MTD),大鼠长期毒性试验的三个剂量分别为,1,、,1/3,及,1/10MTD,；,狗和猴可采用大鼠一半左右的剂量。,（,4,）最大耐受量法（,MTD,法）,可供参考的具体方法,（,1,）半数致死量法（,LD,50,法）,（,2,）短期蓄积试验过渡法,（,3,）药代动力学法（,MBS,法）,根据临床拟用剂量（,3,个月长期毒性试验）,大鼠低、中、高三个剂量可分别采用,50100,倍、,2550,倍和,1020,倍临床剂量,狗可分别采用,3050,倍、,1525,倍和,510,倍临床剂量,猴可采用与狗相近的剂量或略低于狗的剂量进行试验,（,4,）最大耐受量法（,MTD,法）,（,5,）临床拟用剂量法（,ACD,法）,可供参考的具体方法,（,1,）半数致死量法（,LD,50,法）,（,2,）短期蓄积试验过渡法,（,3,）药代动力学法（,MBS,法）,根据人和动物的等效剂量比值，再按一定倍数扩大。,（,4,）最大耐受量法（,MTD,法）,（,5,）临床拟用剂量法（,ACD,法）,（,6,）等效剂量法,2026/2/1 周日,51,不同动物的剂量折算系数,动物种属,小鼠,大鼠,豚鼠,兔,猫,猴,狗,人,标准,K(,剂量折算系数,),1,7,12.3,27.5,29.7,64,124,388,体重,K(kg,体重剂量折算系数,),1,0.71,0.62,0.37,0.30,0.32,0.21,0.11,任何,R(,动物体型系数,),0.059,0.09,0.099,0.093,0.082,0.111,0.104,0.1,体重,W(,标准体重,kg),0.02,0.2,0.4,1.5,2,4,12,70,注：有些资料记载的动物体型系数（,R,）为此表中,R,值的,1000,倍，如小鼠,R,为,59,，大鼠,R,为,90,，这不影响药物剂量的折算。,2026/2/1 周日,52,对于标准体重的动物：,每只用量（,mg/,只）,D,B,D,A,K,B,K,A,千克体重剂量（,mg/kg,）,d,B,d,B,K,B,K,A,K,A,，,K,B,，,R,A,，,R,B,值由上表查找,2026/2/1 周日,53,对于任何体重的动物：,每只用量（,mg/,只）,D,B,D,A,R,B,(,W,B,),2/3,R,A,W,A,千克体重剂量（,mg/kg,）,d,B,d,A,R,B,(,W,B,),2/3,R,A,W,A,式中,D,B,、,d,B,分别是欲计算的,B,种动物的每只剂量及公斤体重剂量，,D,A,、,d,A,分别是已知,A,种动物的每只剂量及公斤体重剂量，,W,A,、,W,B,是已知动物体重，,R,A,、,R,B,是体型系数，可由上表查得,。,可供参考的具体方法,（,1,）半数致死量法（,LD,50,法）,（,2,）短期蓄积试验过渡法,（,3,）药代动力学法（,MBS,法）,（,4,）最大耐受量法（,MTD,法）,（,5,）临床拟用剂量法（,ACD,法）,（,6,）等效剂量法,2026/2/1 周日,55,五、限度试验,我国药政部门规定,，,如小鼠急性毒性的口服,给药剂量大于,5g/kg,，,注射给药剂量大于,2g/kg,仍未产生毒性反应和死亡,，,或仅个别动物有毒性,反应时,，,可考虑只做一个高于临床拟用剂量,50,倍,(,狗用,30,倍,),的剂量组。,2026/2/1 周日,56,经济合作与开发组织,(OECD),提出如果一种,化合物以,1000mg/kg,的剂量,，,按规定期限连续给,药,，,不产生任何可观察到的毒性反应,，,而且根据,结构相关药物的已有资料,，,估计不会产生毒性的,话,，,就不需要再用三个剂量来进行试验,，,除非预,期临床需要更高的剂量。,五、限度试验,2026/2/1 周日,57,六、给药方法,长期毒性试验的给药途径一般应尽量与预期临床使用的途径相一致。,临床用药途径为静脉或肌注时，,3,个月及以上的试验，由于试验周期长大鼠给药有困难，可用腹腔或皮下注射代替。,如采用灌胃给药的方式可将供试药物制成一种溶液或混悬液，但必须注意给药容量不应超过,12ml/100g,体重,/,天。,2026/2/1 周日,58,六、给药方法,长期毒性试验,一般均强调每天给药，每周必须给药,7,天。给药期限长（,3,个月或以上）的药物每周至少应给药,6,天。,2026/2/1 周日,59,七,、观察及测定指标,试验前，啮齿类动物至少应进行,5,天的适应性观,察，非啮齿类动物至少应驯养观察,12,周，应对,动物进行一般观察及血液生化学指标的检测。,试验期间，至少应每天或每两天作一次详细的,观察。,试验结束时，必须留,1/3,的动物做恢复期的观察,试验，其观察期时间一般不超过,28,天。,2026/2/1 周日,60,（,一,）,日常观察,1.,一般,观察,内容,包括对实验动物被毛、皮肤、眼睛、粘膜、,孔道,(,及其分泌物,),、呼吸、循环、自主神经系,统、躯体和肢体活动情况以及精神行为进行仔细,地观察,；,对动物粪便的量、色泽和内含物,，,散失,的食物,，,饮水瓶中残余的水以及一切可以反映动,物生活情况变化的各种迹象,，,都必须加以注意。,所有出现的症状都必须记录在案。,2026/2/1 周日,61,1.,一般,观察,内容,如果发现动物死亡,，,必须尽可能快地进行尸,体剖检,，,以减少组织自溶。将组织置于,10%,的中,性福尔马林或其它适宜的固定液中。如果尸体剖,检不能立即进行,，,则必须将动物,冷藏,起来以延缓,组织自溶。,（,一,）,日常观察,2026/2/1 周日,62,1.,一般,观察,内容,对濒死的动物也应立即处死作尸体剖检。,（,一,）,日常观察,尸体剖检,后行组织病理学检查、评价,。,2026/2/1 周日,63,2.,生长率,（,一,）,日常观察,2026/2/1 周日,64,3.,食耗,食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响,食耗的计算,将加入供食器具中饲料的重量减去剩余的饲料重量再除以给食天数,（,一,）,日常观察,2026/2/1 周日,65,3.,食耗,食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响,食耗的计算,将给药组和对照组的食耗加以比较,，,有助于说明药物是否影响实验动物的食欲。,（,一,）,日常观察,2026/2/1 周日,66,3.,食耗,食耗常用来评价给药对食欲及食物利用率的影响,食耗的计算,将给药组和对照组的食耗加以比较,，,有助于说明药物是否影响实验动物的食欲。,（,一,）,日常观察,如对食欲有影响,，,则每日进食量必然减少,体重增长亦受影响,但此时食物利用率并不一定降低,如果不影响食欲,而体重增长却下降,表明药物有可能影响食物的吸收或合成代谢,此时食物利用率就必然会有变化,2026/2/1 周日,67,（二）测定指标,1.,器官重量,涉及的主要器官有,：,心脏、肝脏、肾脏、脾脏、肺、脑、,肾上腺、甲状腺、,睾丸,、前列腺、子宫,等,。,目的：确定靶器官,2026/2/1 周日,68,年组织编写,药物研究技术指导原则,规定,长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官：,脑,肝脏,肾上腺,脾脏,附睾,子宫,心脏,肾脏,胸腺,睾丸,卵巢,肺脏,2026/2/1 周日,69,年组织编写,药物研究技术指导原则,规定,长期毒性试验中需称重并计算脏器系数的器官：,脑,肝脏,肾上腺,脾脏,附睾,子宫,心脏,肾脏,胸腺,睾丸,卵巢,肺脏,甲状腺、,前列腺,长期毒性试验中进行病理组织学检查的组织或器官：,脑（大脑、小脑、脑干）,垂体,甲状腺,食管,胃,肝脏,肾脏,脾脏,气管,主动脉,附睾,卵巢,前列腺,坐骨神经,眼（眼科检查发现异常时）,给药局部,淋巴结,脊髓,胸腺,甲状旁腺,唾液腺,小肠和大肠,胆囊,肾上腺,胰腺,肺,心脏,睾丸,子宫,乳腺,膀胱,视神经,骨髓,注：为啮齿类动物可不进行组织病理学检查的组织或器官,2026/2/1 周日,71,1.,器官重量,器官重量降低,，,表示该器官萎缩或发育不良,；,器官重量增加提示可能有充血,、,水肿、增生、肥大、酶诱导变化或新生物等。,将动物处死后取出上述器官,，,除去附着的组,织、除尽余血后立即称重,（,注意勿使组织干燥,）,。,（二）测定指标,2026/2/1 周日,72,2.,血液学,（二）测定指标,常规的血液学参数,骨髓涂片,1.,器官重量,2026/2/1 周日,73,年组织编写,药物研究技术指导原则,规定,血液学指标,红细胞计数,红细胞容积,平均红细胞血红蛋白,网织红细胞计数,血小板计数,血红蛋白,平均红细胞容积,平均红细胞血红蛋白浓度,白细胞计数及分类,凝血酶原时间,红细胞压积,2026/2/1 周日,74,血液学指标,观察时间,非,啮,齿类动物,一般于整个试验周期中每隔,1.5,2,个月采血测定一次各项指标。,啮,齿类动物,试验周期为,6,个月时,，,可于试验中期、试验末,期以及恢复期分别剖杀部分动物,(,约,1/4,、,2/4,、,1/4),，,进行各项检查,；,试验周期为,3,个月时,，,可于试验未期以及恢复,期分别剖杀部分动物,(,约,2/3,、,1/3),，取血,检查。,（二）测定指标,2026/2/1 周日,75,3.,血液生化学,注意,事项：,采血时从各组中随机捉取动,物，,样本不能溶血,使用足够数量的动物,采样前禁食,12,小时,使用合适的统计学分析方法,，,注意剂量,反应关,系,；,将所得资料和数据与同种、同龄、同性别、,同生理状况的实验动物的资料加以比较分析,（二）测定指标,2.,血液学,1.,器官重量,2026/2/1 周日,76,年组织编写,药物研究技术指导原则,规定,血液生化学指标,天门冬氨酸氨基转换酶,碱性磷酸酶,尿素氮,总蛋白,血糖,总胆固醇,谷氨酰转移酶,氯离子浓度,丙氨酸氨基转换酶,肌酸磷酸激酶,肌酐,白蛋白,总胆红素,甘油三酯,钾离子浓度,钠离子浓度,2026/2/1 周日,77,3.,血液生化学,（二）测定指标,2.,血液学,1.,器官重量,4.,尿液分析,2026/2/1 周日,78,尿液分析指标,尿液外观,pH,值,尿蛋白,尿胆原,潜血,比重,尿糖,尿胆红素,酮体,白细胞,年组织编写,药物研究技术指导原则,规定,2026/2/1 周日,79,八,、,恢复期,观察,最后一次给药物后,24,小时，每组活杀部分动,物检测上述各项指标，留下,1/31/4,动物进行恢复,期观察。观察期一般不超过,28,天，而后再活杀检,查,上述,所有指标，以了解毒性反应的可逆程度和,可能出现的延迟性毒性反应。,2026/2/1 周日,80,综合评价,长期毒性试验是药物非临床安全性研究的有机组成部分，是药物非临床毒理学研究中综合性最强、获得信息最多和对临床指导意义最大的一项毒理学研究。对其结果进行评价时，应结合受试物的药学特点，药效学、药代动力学和其他毒理学研究的结果，以及已取得的临床研究的结果，进行综合评价。,2026/2/1 周日,81,本章复习,长期毒性试验,；,蓄积作用,。,蓄积作用,的表现形式有几种？,我国药政部门对长期毒性试验动物数的要求。,长期毒性试验时检查的器官包括哪些？,恢复期观察。,剂量水平的选择有哪几种具体方法参考？,2026/2/1 周日,82,本章复习,长期毒性试验的目的。,长期毒性试验的总原则,？,