微生物发酵机制.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,Click to,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,第七章 微生物发酵机制,发酵的类型,根据微生物的种类不同，可分为好氧性发酵、厌氧性发酵和兼性发酵。,（,1,）,好氧性发酵,：在发酵过程中需要通入一定量的无菌空气，满足微生物呼吸需要。,（,2,）,厌氧性发酵,：在发酵过程中不需要供给无菌空气。,（,3,）,兼性发酵,：,在有氧、无氧条件下均能生活。如,酿酒酵母,，在缺氧条件下进行厌气性发酵积累酒精，而在有氧条件下则进行好氧发酵，大量繁殖菌体细胞。,发酵机制：,微生物通过其代谢活动，利用基质（底物）合成人们所需要的代谢产物的内在规律,积累的产物,微生物菌体,酶,代谢产物,厌气发酵：,酒精、,甘油、,乳酸、,丙酮、,丁醇等,好气发酵：,有机酸、,氨基酸、,蛋白质、,核苷酸、,抗生素、,维生素等,代谢控制发酵：,人为的改变微生物的代谢调控机制，使有用的代谢产物过量的积累。,发酵机制研究的内容：,1.,微生物的生理代谢规律（就是各种代谢产物合成途径及代谢调节机制）；,2.,环境因素（营养条件、培养条件等）对代谢的影响及改变代谢的措施；,糖酵解途径及调节机制,葡萄糖经,EMP,途径：,C,6,H,12,O,6,+2ADP+2Pi+2NAD 2CH,3,COCOOH+2ATP+2NADH,2,EMP,糖酵解途径,糖酵解途径及特点,EMP,途径大致可分为三个阶段,1,，,6-,二磷酸果糖的生成，消耗,2,分子,ATP,；,1,，,6-,二磷酸果糖降解为,3-,磷酸甘油醛；,3-,磷酸甘油醛经五步反应转化为丙酮酸，产生,4,分子,ATP,它是动物、植物、微生物细胞中,G,分解产生能量的共同途径。,EMP,的每一步都是由酶催化的。己糖激酶；磷酸果糖激酶（该酶受,ATP,、,柠檬酸的抑制，为,AMP,所激活）；丙酮酸激酶；,3-,磷酸甘油醛脱氢酶（受碘乙酸抑制）；烯醇化酶（受氟化物抑制）。,当以其他糖类作为碳源和能源时，先通过少数几步反应转化为糖酵解途径的中间产物，,然后沿着糖酵解途径进行降解。,丙酮酸的不同去路。反应中生成的,NADH,2,不能积存，必须被重新氧化为,NAD,后，才能继续不断地推动全部反应，,在不同的机体，在不同的环境下（如氧气的有无），氢的受体不同，丙酮酸的去路也不同。,在无氧,条件下：,在,乳酸菌,中受乳酸脱氢酶的作用，丙酮酸作为受氢体而被还原为乳酸，即同型乳酸发酵；,在,酵母菌,中，丙酮酸受丙酮酸脱羧酶的作用生成乙醛，乙醛在乙醇脱氢酶的作用下作为受氢体被还原为乙醇，即酒精发酵；,在,梭状芽孢杆菌,中，丙酮酸脱羧生成乙酰,COA,，,然后经一系列变化生成丁酰,COA,、,丁醛，两者作为受氢体被还原生成丁醇，生成物中还有丙酮、乙醇，所以称为,丙酮,-,丁醇发酵,。,乙醇,乳酸,在好氧发酵条件,丙酮酸进入,TCA,环,，进行代谢，产生各种好氧代谢产物或完全氧化获得能量。,B,、,三羧酸循环,三羧酸循环一定需要,氧,才能进行。在三羧酸循环中脱下的,氢,，形成,NADH,和,FADH,2,，,然后再逐步传递给,氧,。,丙酮酸,三个二氧化碳,三,羧酸循环,A.,厌氧,发酵机制,第一节,酒精发酵机制,1,酵母菌的酒精发酵,1.1,酒精生成机制,(1),葡萄糖,（,glucose,）,EMP,丙酮酸（,pyruvic,acid,）,己糖磷酸化作用,EMP,六碳糖转变为三碳糖,磷酸丙糖 丙酮酸,(2),丙酮酸乙醇,丙酮酸,丙酮酸脱羧酶,乙醛（,acetaldehyde,）,乙醛,乙醇脱氢酶,乙醇,（,alcohol,）,由葡萄糖生成乙醇的总反应式为,C,6,H,12,O,6,+2ADP,+,2H,3,PO,4,2CH,3,CH,2,OH+2CO,2,+2ATP,酵母菌在无氧的条件下，通过以上,12,步反应，,1,分子,G,生成分子的乙醇，分子的,CO,2,和,2,分子,ATP,。,则,1mol,葡萄糖生成,2mol,乙醇，理论转化率为,2,46.05/180.1100%=51.1%,但是在生产中大约有,5%,的葡萄糖用于合成酵母细胞和副产物，,实际上乙醇生成量约为理论值的,95%,，则乙醇对糖的,实际转化率约为,48.5%,。,巴斯德效应,巴斯德效应,:,好气条件下，酵母菌发酵能力下降（细胞内糖代谢降低，乙醇积累减少）；,好气条件下，代谢进入,TCA,环柠檬酸、,ATP,抑制激酶,6-P-,葡萄糖反馈抑制己糖激酶抑制葡萄糖进入细胞内葡萄糖利用降低。,同时，好气条件下，丙酮酸激酶活性降低。,丙酮酸激酶活性降低也是由于磷酸果糖激酶活性降低所致。,丙酮酸激酶活性使磷酸烯醇式丙酮酸反馈抑制己糖激酶活性糖酵解速度,1.2,酒精发酵中副产物的形成,主产物（,product,）,：乙醇（,alcohol,）,副产物（,by product,）：,40,多种,二氧化碳（,carbon dioxide,）,甘油（,glycerol,）,乙醛（,acetaldehyde,）,琥珀酸（,succinic,acid,）,乙酸（,acetic acid,）,酯（,ester,）,高级醇（,higher alcohol,）,双乙酰（,diacetyl,）,1.2.1,杂醇油的生成,杂醇油是碳原子数大于,2,的脂肪族醇类的统称，主要由正丙醇、异丁醇、异戊醇和活性戊醇组成，这些高级醇是构成,酒类风味,的重要组成成分之一，当其,过量,时会影响产品质量，是酒类产品中质量指标之一，应予以,控制,。,1.2.1.1,酒精发酵中高级醇的形成途径,a.,氨基酸氧化脱氨,作用,b,由,葡萄糖直接生成,酒精发酵中高级醇形成的途径,（,1,）氨基酸氧化脱氨作用,缬氨酸 异丁醇 异亮氨酸 活性戊醛,酪氨酸 酪醇 苯丙氨酸 苯乙醇,亮氨酸,酮戊二酸,酮异己酸,转氨酶,+,谷氨酸,异戊醇,异戊酸,醇脱氢酶,（,2,）,由葡萄糖直接生成,酮酸,（碳原子低的）,活性乙醛,酮酸,（碳原子高的,）,还原、异构、脱水,醇,缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸,醇,1.2.1.2,影响杂醇油形成的条件,a.,菌种,:,在同样的条件下，不同菌种的杂醇油生成量相差很大。酵母的杂醇油生成量与,醇脱氢酶,活性关系密切，该酶活力高，杂醇油生成量大。,b.,培养基组成,:,培养基中支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）的存在，可增加相应的高级醇（异戊醇、活性戊醇和异丁醇）的生成量。培养基中氮水平高，形成杂醇油量少，,杂醇油总形成量因氮水平高而降低。,c.,发酵条件,:,一般发酵,温度高,，高级醇生成量高，,通风,有利于高级醇生成。高级醇的生成与乙醇的生成是平行的，随乙醇的生成而生成。,1.2.2,双乙酰（,diacetyl,）,1.2.2.1,双乙酰合成途径,双乙酰是啤酒生产过程中的重要成分，它是酵母细胞内生物合成,缬氨酸、亮氨酸的中间产物,；也是衡量啤酒成熟和质量水平的主要指标。它赋予啤酒一种,不愉快的馊味，,淡色贮藏啤哂的双乙酰含量应控制在,0.1mg/L,以下。,双乙酰是,-,乙酰乳酸在酵母细胞外非酶氧化的产物，是酵母在生长繁殖时，在酵母细胞体内用可发酵性糖经,-,乙酰乳酸合成它所需的缬氨酸、亮氨酸途径中的副产物，中间产物,-,乙酰乳酸部分,排出,酵母,细胞体外,，经,氧化脱羧作用,生成双乙酰。,CH,3,CHO-T,PP,(,活性乙醛,),CH,3,COCOOH,-,乙酰乳酸 缬氨酸,双乙酰,2,3-,丁二醇,非酶氧化,酵母还原,+,双乙酰合成消除途径,1.2.2.2,双乙酰的消除,措施,:,.,提高麦汁中,氨基氮的含量,；,提高麦汁中,缬氮酸,的含量通过,反馈作用,，抑制从丙酮酸合成缬氨酸的支路代谢作用。,.,利用酵母的还原作用，将双乙酰转变成,2,3-,丁二醇；,.,利用,二氧化碳的洗涤作用,，排除双乙酰。,4.,加入,-,乙酰乳酸脱羧酶,;,5.,使用基因工程构建的含有,-,乙酰乳酸脱羧酶的酵母菌株,酯是啤酒香味的主要组成成分，它是通过酯酰辅酶,A,与醇缩合而形成的。,传统淡色啤酒以,酒花,香为主体香，含有,适量的酯,，才使啤酒香味丰满协调。过高的酯含量会使啤洒有不愉快的香味。近代啤酒中的酯含量与高级醇一样，普遍有升高的趋势。有的酒其,乙酸乙酯,大于阈值，有淡雅的果实香味，也成为一种独特的风味。,1.3,酯类物质,啤酒的香味,果酒的香味,酒花香,麦芽香,发酵过程形成的各种,酯类的香味,果香,发酵香,陈酿香,形成途径：,通式：,R-CO-SCOA,+R,OH RCOOR,+COA-SH,R-CO-SCOA,脂肪酸的激活作用,酮酸的氧化作用,在,ATP,的作用下，使脂肪酸活化,酮酸的氧化作用,R-COOH+ATP+COA-SH,RCO,SCOA+AMP+,PPi,RCOCOOH+NAD+COASH,RCO-SCOA+NADH,2,+CO,2,影响,酯含量,因素,:,a.,酵母,菌种,，不同的酵母菌种，发酵时形成的酯量是不同的；,b.,发酵,温度高,，有利于酯类的形成；,c.,接种量大，,酯类的形成量低。,2.,细菌的酒精发酵,（,alcoholic fermentation of bacteria),菌种为,运动发酵单孢菌,（,Zymomonas,Mobilis,），,少数假单胞杆菌,（,Pseudomonas,），,如林氏假单胞菌（,Ps.lindneri,）,能利用,G,经,ED,途径进行酒精发酵。,总反应式为,C,6,H,12,O,6,+ADP+H,3,PO,4,2C,2,H,5,OH+2CO,2,+ATP,产物和酵母菌的酒精发酵相同，但产能水平各异。,ED,途径,(,脱氧酮糖,酸途径,),由,部分,EMP,途径,、,部分,HMP,途径,组成,ED,途径的,三个阶段,1,、,G,氧化分解,6-,磷酸葡萄糖酸,+NADPH,（,HMP,）,2,、,6-,磷酸葡萄糖酸,三碳糖,6-P-,葡萄糖酸脱水酶,6-P-,葡萄糖酸,2-,酮,-3-,脱氧,-6-P-,葡萄糖酸,2-,酮,-3-,脱氧,-6-P-,葡萄糖酸 丙酮酸,+3-P-,甘油醛,3,、氧化产能阶段,3-P-,甘油醛,EMP,丙酮酸,总反应式,C,6,H,12,O,6,+NADP,+,+NAD,+,+ADP+Pi,2CH,3,COCOOH+NAD 2H,+,+NADP 2H+ATP,细菌酒精发酵的特点,代谢速度快；,发酵周期短，比酵母菌的酒精产率高；,厌氧且耐高温；,能利用多种糖类,发酵工艺技术要求高,优点：,缺点：,第二节 乳酸发酵机制,一、同型乳酸发酵：,进行乳酸发酵的主要是细菌。,它们利用糖经糖酵解途径生成丙酮酸，丙酮酸还原产生乳酸。发酵产物中主要为乳酸的称为,同型乳酸发酵,。,如,乳链球菌,（,Streptococcus,lactics,）、,乳酪链球菌,（,Streptococcus,cremoris,）、,干酪乳杆菌,（,lactobacillus,casei,）、,保加利亚乳杆菌,（,Lac.,bulgaricus,）等。,2H,（乳酸脱氢酶）,C,6,H,12,O,6,EMP,2CH,3,COCOOH,2CH,3,CHOHCOOH,同型乳酸发酵的特点：,1mol,的,G,产生,2mol,乳酸，理论转化率是,100%,。另外有很少量的乙醇、乙酸和二氧化碳等。,二、异型乳酸发酵,发酵产物中除,乳酸,外同时还有,比例较高,的,乙酸、乙醇、二氧化碳,等，称为异型乳酸发酵。,其生物合成途径有两种。,1.,6-,磷酸葡萄糖酸途径：,葡萄糖经,6-,磷酸葡萄糖生成,5-,磷酸核酮糖，再经差向异构作用生成,5-,磷酸木酮糖；后者经磷酸解酮酶催化，分解为,3-,磷酸甘油醛和乙酰磷酸。乙酰磷酸经磷酸转乙酰酶作用变为乙酰,CoA,，再经乙醛脱氢酶作用生成乙醇。而,3-,磷酸甘油醛经,EMP,途径生成丙酮酸。后者经乳酸脱氢酶催化还原为乳酸。,葡萄糖,ATP,ADP,6,磷酸葡萄糖,1,NAD,NADH,H,6,磷酸葡萄糖酸,2,NAD,NADH,H,5,磷酸核酮糖,3,5,磷酸木酮糖,乙酰磷酸,乙酰,乙酰,CoA,NADH,H,NAD,乙醛,NADH,H,NAD,乙醇,3,磷酸甘油醛,乳酸,ADP,ATP,NAD,NADH,H,NAD,NADH,H,4,8,5,7,6,6,磷酸葡萄糖酸生成乳酸和乙醇,己糖激酶,6,磷酸葡萄糖脱氢酶,6,磷酸葡萄糖酸脱氢酶,4.5,磷酸核酮糖,3,差向异构酶,5.,磷酸解酮酶,6.,磷酸转乙酰酶,7.,乙醛脱氢酶,8.,醇脱氢酶,通过该途径，,1mol,的,G,产生,1mol,的乳酸，乳酸对糖的理论转化率是,50%,。另外有比例较高的乙醇、乙酸和二氧化碳等。,肠膜明串珠菌,（,Leuconostoc,mesenteroides,）及,葡聚糖明串珠菌,（,Leuconostoc,dextranicum,）通过该途径进行,异型乳酸发酵,。,2.,Bifidus,途径（双歧途径）：,双歧杆菌（,Bifidobacterium,bifidum,),进行的乳酸发酵,也是一条,磷酸解酮酶途径,。,该途径的特点是：,有两个磷酸解酮酶参与,；,在没有氧化作用和脱氢作用下，,2,分子,G,分解为,3,分子乙酸和,2,分子,3-,磷酸甘油醛。接着，在,3-,磷酸甘油醛脱氢酶和乳酸脱氢酶的参与下，,3-,磷酸甘油醛转化为乳酸，转化率为,50%,。,葡萄糖,ATP,ADP,6,磷酸果糖,6,磷酸果糖,ADP,Pi,4,磷酸赤藓糖,3,磷酸甘油醛,7,磷酸景天庚酮糖,5,磷酸木酮糖,5,磷酸核糖,乙酰磷酸,ATP,乙酰,5,磷酸木酮糖,5,磷酸核酮糖,乙酰磷酸,2,分子,3,磷酸甘油醛,乳酸,ADP,ATP,NAD,NADH,H,NAD,NADH,H,ADP,ATP,3,分子乙酸,葡萄糖经双歧途径发酵生成乳酸和乙酸,1,3,2,4,5,6,7,6-,磷酸果糖解酮酶,转二羟基丙酮基酶,转羟乙醛基酶,5,磷酸核糖异构酶,5,磷酸核酮糖,3,差向异构酶,5,磷酸木酮糖磷酸酮解酶,乙酸激酶,第三节 甘油发酵机制,一、亚硫酸盐法甘油发酵,酵母菌在酒精发酵时，如加入,亚硫酸氢钠,等盐类，它能与乙醛起,加成,作用，生成,难溶,的,结晶状,亚硫酸钠加成物，这样就使乙醛不能作为受氢体，而迫使磷酸二羟丙酮作为受氢体，在,-,磷酸甘油脱氢酶（,NAD,为辅酶）催化下生成,-,磷酸甘油,，后者在,-,磷酸甘油磷酸酯酶催化下,生成,-,甘油,。,CH,2,OH OH,C,6,H,12,O,6,+,NaHSO,3,CHOH+CH,3,-,C-H OSO,2,Na+CO,2,CH,2,OH,2ATP,2ADP,2ADP,2ATP,CO,2,NaHSO,3,NAD,NADH+H,NADH+H,NAD,H,2,O,Pi,酵母菌酒精发酵,型,葡萄糖,1.6-,二磷酸果糖,3-,磷酸甘油醛,磷酸二羟丙酮,丙酮酸,乙醛,乙醛,HSO3,-,磷酸甘油,甘油,1m,ol,葡萄糖只产生,1mol,甘油，不产生,ATP,，,整个过程无,ATP,积余，可见在甘油发酵过程中亚硫酸盐不能加得太多，否则会使酵母菌因,得不到能量而终止发酵,，必须留一部分酒精发酵，以使获得一些能量，供生命活动所需。,该过程也称,酵母菌的,II,型发酵,。,二,碱法甘油发酵,酒精酵母的发酵液在,保持碱性（,pH7.6,以上）的条件,下，乙醛不能作为正常的受氢体，乙醛在碱性溶液里分子乙醛之间发生,歧化,反应，,相互氧化还原,，生成等量的,乙醇和乙酸,。此时，由磷酸甘油醛脱氢生成的,NADH+H,+,用来还原磷酸二羟丙酮，并进而生成甘油,CH,2,OH,2C,6,H,12,O,6,+H,2,O,2CHOH+C,2,H,5,O,H+CH,3,COOH+2CO,2,CH,2,OH,碱法甘油发酵的产品有,甘油、乙醇、乙酸,，也不产,生,ATP,，,所以此法只能在酵母的非生长情况下进行,发酵。,该过程也称,酵母菌的,型发酵,。,第四节 沼气发酵机制,沼气（,biogas,）,(,甲烷，,methane),甲烷发酵属于,厌氧消化,(,anaerobic digestion),处理，是,有机物厌氧分解过程中,的主要过程。利用厌氧菌将工厂废水、下水污泥中所含有的有机物进行分解，不用对培养基进行灭菌和纯种培养和接种操作。它可以作为好氧处理的前阶段处理。,甲烷气体（沼气）是生物燃气的主要成员。,一、甲烷发酵机理,甲烷发酵是厌氧菌将碳水化合物、脂肪、蛋白质等复杂的有机物最终分解成甲烷和,CO,2,，,甲烷发酵不是由单一的甲烷产生菌所能完成的，甲烷发酵至少由三个阶段组成,：,第一个阶段是有机聚合物水解生成单体化合物，进而分解成各种,脂肪酸,、,CO,2,和,H,2,；,第二阶段是各类脂肪酸进行分解，生成,乙酸,、,CO,2,和,H,2,；,第三个阶段是由乙酸和,CO,2,及,H,2,反应生成,甲烷,；,前两个阶段也可统称为,产酸阶段,，产酸阶段也叫,液化阶段,，参与这一阶段反应的微生物大部分是兼性厌氧细菌，只有少数的原生动物、霉菌和酵母参与这一反应。发酵液中这一类,非甲烷产生菌,的,数量,大体上与,甲烷产生菌,相等,。,第三个阶段的产气称为,甲烷发酵，,参与这一过程的细菌总称为,甲烷菌,。,复杂有机物,发酵细菌,可溶性简单有机物,产酸菌,挥发性,脂肪酸,（丙酸，异丁酸，异戊酸）,专性质子还原菌,醋酸,H,2,+HCO,3,纯醋酸菌,C H,4,甲烷菌,CH,4,HCO,3,H,+HCO,3,H,2,CO3,H,2,O+CO,2,H,2,O,二、甲烷发酵的微生物,产酸阶段也叫液化阶段，参与的微生物大部分是兼性厌氧菌，只有少量的原生动物、霉菌和酵母参与这一反应。,产酸阶段的细菌有：梭菌属（,Clostridium,）；,芽孢杆菌（,Bacillus,）；,葡萄球菌属（,Staphlococccus,）；,变形杆菌属（,Froteis,）；,杆菌属,(,Bacterium,),。,甲烷产生阶段主要是,甲烷产生菌,参与。,产甲烷菌是严格厌氧菌，不产孢子。,采用新的厌气培养技术，可以分离得到,20,种以上的甲烷产生菌，如：,甲烷杆菌属（,Methanobacterium,）；,甲烷短杆菌属（,Methanobrevibacterium,）；,产甲烷菌属（,Methanococci,）；,甲烷微球菌属（,Methanomicrobium,）等细菌。,各种甲烷菌之间在,RNA,排列顺序上都很相似，它们都是具有,嗜盐性,，而且比典型的细菌,耐温和耐酸,。所以有人将甲烷菌和嗜盐菌、嗜热菌、嗜酸菌等一起分类属于,古细菌,。,甲烷菌和非甲烷菌叫沼气菌（,biogas producing bacteria,）。,发酵液中非甲烷产生菌的数量与甲烷产生菌相等，达,10,6,10,8,个,/ml,。,甲烷发酵的三个阶段是相互依赖和连续进行的，并保持动态平衡。如果平衡遭到破坏，沼气发酵就受到影响，甚至停止。,三、甲烷发酵的各种条件,1),菌种培养：取自然界正在进行甲烷发酵的,河沟或沼泽底部的污泥,或工厂废水加入甲烷发酵槽，保持适当温度，使细菌繁殖；,2),发酵温度：中温发酵,37,C,38,C,；,高温发酵,53,C,54,C,；,在一种温度下长期持续培养，在另一种温度下就很难获得满意的效果，这是因为两类甲烷菌种类不同造成的。,高温,发酵处理能力较低温发酵大,2.5,倍,。,3),废水组成：废水中要有营养，除作为能源的碳源外，还有氮源。废水中的磷不足，可用化肥补充，甲烷发酵的最适,p,值为,7,，不适时，可进行中和；,4),污泥浓度：甲烷发酵中，持续进行的厌氧污泥将在液体中积累，含有甲烷细菌体、碳酸盐、氢氧化钠、硫化物、未分解的污泥残渣，污泥越多，越能促进甲烷发酵；,5),抑制物：有硫化物、硝酸盐、许多重金属、洗涤剂和醇类特别是不饱和醇，首先抑制甲烷菌，使气体减少，抑制物浓度再高，产酸菌也受到抑制。,B.,好氧,发酵机制,好氧性发酵,(aerobic fermentation),：,在发酵过程中需要不断地通入一定量的无菌空气，如利用,黑曲霉,进行柠檬酸的发酵、利用,棒状杆菌,进行谷氨酸的发酵、利用,黄单孢菌,进行黄原胶多糖的发酵等等,糖的分解代谢包括糖酵解（糖的共同分解途径）和三羧酸环（糖的最后氧化途径）。,第一节 柠檬酸的发酵机制,一、柠檬酸的合成途径,黑曲霉,(,Asp.niger,),原料：糖类,，,乙醇，,醋酸,途径：,EMP,（,HMP,）,丙酮酸羧化,TCA,环,黑曲霉生长，,EMP,与,HMP,途径的比率是,2,：,1,，生产柠檬酸时为,4,：,1,。,葡萄糖 柠檬酸,(citric acid),理论转化率：,106.7%,柠檬酸的发酵机制,柠檬酸在食品中的应用,柠檬酸发酵微生物,柠檬酸发酵机理,1),饮料与冰淇淋,柠檬酸广泛用于配制各种水果型的饮料以及软饮料,柠檬酸本身是果汁的,天然成分,之一，不仅赋于饮料水果风味，而且具有增溶、缓冲、抗氧化等作用，能使饮料中的糖、香精、色素等成分交融协调，形成适宜的口味和风味；添加柠檬酸可以改善冰淇淋的口味，增加乳化稳定性，防止氧化作用。,2),果酱与酿造酒,柠檬酸在,果酱,与,果冻,中同样可以增进风味，并使产品抗氧化作用。由于果酱、果冻的凝胶性质需要一定范围的,pH,值，添加一定量的柠檬酸可以满足这一要求。,当葡萄或其它,酿酒,原料成熟过度而酸度不足时，可以用柠檬酸调节，以防止所酿造的酒口味单薄。柠檬酸加到这些果汁中还有抗氧化和保护色素的作用，以保护果汁的新鲜感和防止变色。,3),腌制品,各种肉类和蔬菜在腌制加工时，加入或涂上柠檬酸可以改善风味，除腥去臭，抗氧化。,4),罐头食品,加入柠檬酸除了调酸作用之外，还有螯合金属离子的作用，保护其中的抗坏血酸，使之不被金属离子破坏。柠檬酸添加到植物油中也有类似的作用。,5),豆制品及调味品,用含有柠檬酸的水浸渍大豆，可以脱腥并便于后续加工。柠檬酸可以用于大豆等豆类蛋白、葵花子蛋白的水解，生产出风味别致的调味品。它也可以用于成熟调味品（酱油等）的调味。,6),其它,柠檬酸在医药、化学等其它工业中也有一定的作用。柠檬酸铁胺可以用作补血剂；柠檬酸钠可用作输血剂；柠檬酸可制造食品包装用薄膜及无公害洗涤剂。,柠檬酸的消费领域：,饮料行业占,40,45,食品添加剂等占,15,20,洗涤剂占,20,30,医药占,5,其它占,10,2004,年全球柠檬酸产量约,120,万吨，欧盟和美国为最大消费市场。,柠檬酸是目前世界上以生物化学方法生产，产量最大的有机酸。,我国是柠檬酸的第一大生产国，估计年产约,50,万吨,欧洲是柠檬酸的第二大生产地，产量约,30,万吨,美国柠檬酸年产量约,25,万吨,柠檬酸发酵微生物,黑曲霉,分生孢子头,柠檬酸发酵机理,TCA,循环与乙醛酸循环,柠檬酸积累的代谢调节,柠檬酸积累机理,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰辅酶,A,柠檬酸,顺乌头酸,衣康酸,异柠檬酸,草酰琥珀酸,酮戊二酸,谷氨酸,琥珀酰辅酶,A,琥珀酸,延胡索酸,葡萄糖,苹果酸,草酰乙酸,乙醛酸,乙酰辅酶,A,1,2,3,3,16,4,5,15,6,7,8,9,10,12,11,14,13,TCA,循环与乙醛酸循环,柠檬酸,合成酶,ATP,降低,限速反应,延胡索,酸酶,关键酶,-,酮戊二酸脱氢酶,异柠檬酸脱氢酶,异柠檬酸脱氢酶,顺乌头酸酶,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰辅酶,A,柠檬酸,顺乌头酸,衣康酸,异柠檬酸,草酰琥珀酸,酮戊二酸,谷氨酸,琥珀酰辅酶,A,琥珀酸,延胡索酸,葡萄糖,苹果酸,草酰乙酸,乙醛酸,乙酰辅酶,A,1,2,3,3,16,4,5,15,6,7,8,9,10,12,11,14,13,TCA,循环与乙醛酸循环,反馈抑制,苹果酸,脱氢酶,CO,2,参与嘌呤和嘧啶的合成,脂肪酸,天冬氨酸,参与蛋白,质合成,参与蛋白,质合成,丙酮酸,脱氢酶,葡萄糖,苹果酸,柠檬酸,草酰乙酸,顺乌头酸,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰,CoA,CO,2,柠檬酸,的生物合成途径,实现柠檬酸积累：,一、设法阻断代谢途径，实现柠檬酸的积累,二,、代谢途径被阻断部位之后的产物，必须有适当的补充机制,CO,2,ATP,ADP,CO,2,ADP,ATP,磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,丙酮酸羧化酶,顺乌头酸酶,抑制剂,阻断,柠檬酸发,酵机理,葡萄糖,苹果酸,柠檬酸,草酰乙酸,顺乌头酸,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰,CoA,CO,2,柠檬酸,的生物合成途径,顺乌头酸酶,抑制剂,阻断,柠檬酸,积累的代谢调节,糖酵解,及丙酮酸代谢的调节,黑曲霉在缺锰的培养基中培养时，可提高,NH,4,+,浓度，高浓度,NH,4,+,可有效解除,ATP,、,柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制。,葡萄糖,葡萄糖,-6-,磷酸,ATP,ADP,果糖,-6-,磷酸,ATP,ADP,Mg,2+,果糖,-1,，,6-,二磷酸,甘油醛,-,3-,磷酸,二羟丙酮,磷酸,2Pi,1,，,3-,二磷酸甘油酸,2ADP,2ATP,3-,磷酸甘油酸,2-,磷酸甘油酸,2H,2,O,Mg,2+,磷酸烯醇式丙酮酸,2ATP,2ADP,烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乳酸,2CO,2,乙醛,+2H,+,2NAD,+,2(NADH+H,+,),+2H,+,乙醇,糖酵解和酒精发酵的全过程,磷酸果糖激酶,AMP,无机磷,NH4,+,活化,抑制,解除,柠檬酸,柠檬酸,积累的代谢调节,三羧酸循环,的调节,柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸,顺乌头酸酶,含,铁,的非血红蛋白，以,Fe,4,S,4,作为辅基。,且反应需要,Fe,+,适量加入亚铁氰化钾（黄血盐），与,Fe,+,生成络合物，则酶失活或活性减少，而积累柠檬酸。,诱变或其他方法，造成生产菌种顺乌头酸酶的缺损或活力很低，同样积累柠檬酸,。,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰辅酶,A,柠檬酸,顺乌头酸,衣康酸,异柠檬酸,草酰琥珀酸,酮戊二酸,谷氨酸,琥珀酰辅酶,A,琥珀酸,延胡索酸,葡萄糖,苹果酸,草酰乙酸,乙醛酸,乙酰辅酶,A,1,2,3,3,16,4,5,15,6,7,8,9,10,12,11,14,13,TCA,循环与乙醛酸循环,CO,2,柠檬酸合成酶,高能硫酯键,能量,Fe,2+,Fe,2+,亚铁氰化钾,顺乌头酸酶,葡萄糖,苹果酸,柠檬酸,草酰乙酸,顺乌头酸,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰,CoA,柠檬酸,积累的代谢调节,及时补加草酰乙酸,外加草酰乙酸,回补途径旺盛的菌种,组成型的丙酮酸羧化酶,丙酮酸羧化酶,回补途径,顺乌头酸酶,抑制剂,阻断,柠檬酸,积累的代谢调节,糖酵解及丙酮酸代谢的调节,三羧酸循环的调节,及时补加草酰乙酸,葡萄糖,苹果酸,柠檬酸,草酰乙酸,顺乌头酸,乙酰,CoA,丙酮酸羧化酶,回补途径,丙酮酸,磷酸烯醇式丙酮酸,顺乌头酸酶,抑制剂,阻断,1,、,由于锰的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的,NH,4,+,浓度升高，促进了,EMP,途径的畅通。,2,、,由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。,柠檬酸积累机理,黑曲霉,柠檬酸积累机理,3,、,在控制,Fe,+,含量的情况下，顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累。,顺乌头酸水合酶在催化时建立如下平衡,柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸,90,：,3,：,7,4,、,丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶和丙酮酸固定,CO,反应相平衡,柠檬酸合成酶不被抑制，增强了合成柠檬酸的能力。,柠檬酸积累机理,葡萄糖,苹果酸,柠檬酸,草酰乙酸,顺乌头酸,磷酸烯醇式丙酮酸,丙酮酸,乙酰,CoA,丙酮酸羧化酶,回补途径,柠檬酸积累机理,5,、,柠檬酸积累增加，,pH,降低，在低,pH,条件下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，从而进一步促进了柠檬酸自身的积累。,柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸,草酰琥珀酸,目的产物,提供,4C,化合物,TCA,循环,由于,TCA,循环降低，,ATP,的生成减少，蛋白质和核酸合成受阻，细胞内的,NH,4,+,异常高，从,而,降低,了柠檬酸对,PFK,的抑制。,柠檬酸发酵需要下述环境条件：,磷酸盐浓度低；氮源为,NH,4,+,盐；,pH,值低（低于,2.0,）；溶氧量高；,Mn,2+,、,Fe,2+,、,Zn,2+,含量极低。,柠檬酸发酵中,黑曲霉,对,Mn,2+,极端敏感,。,黑曲霉在缺锰的条件下发酵，细胞有生理和代谢的变化。,Mn,2+,的效应可以认为是,NH,4,+,水平升高而减弱了柠檬酸对EMP途径关键酶（PFK）的抑制。,柠檬酸积累机理,1,、由于锰的缺乏，抑制了蛋白质的合成，而导致细胞内的,NH,4,+,浓度升高，,促进了,EMP,途径的畅通。,2,、由组成型的丙酮酸羧化酶源源不断提供草酰乙酸。,3,、在控制,Fe,+,含量的情况下，,顺乌头酸酶活性低，从而使柠檬酸积累,。,顺乌头酸水合酶在催化时建立如下平衡,柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸,90,：,3,：,7,第二节,醋酸,发酵机制,淀粉 糖 酒精 醋酸,1.,醋杆菌,发酵酒精成醋酸,乙醇向醋酸转化是分两步进行的，中间产物是,乙醛,。,CH,3,CH,2,OH,E,1,CH,3,CHO,E,2,CH,3,COOH,E,1,乙醇脱氢酶,或乙醇氧化酶，它依赖于,NAD,。,E,2,乙醛脱氢酶，需要,NADP,作辅酶。,醋杆菌为,G,-,，,好氧菌,，,1mol,乙醇转化为,1mol,醋酸，理论转化率是,130,。,2,热醋酸梭菌,生产醋酸,热醋酸梭菌在发酵糖类时，,由糖到醋酸,一步完成,，还,可以将,CO,2,还原为醋酸。,CO,2,是通过甲酰四氢叶酸（,THF,）,和类咕啉蛋白形成醋酸的。但该菌没有氢化酶活性，不能利用氢气。,C,6,H,12,O,6,+2H,2,O 2CH,3,COOH+2,CO,2,+8H,+,+8e,2,CO,2,+8H,+,+8e,CH,3,COOH+2H,2,O,净反应,C,6,H,12,O,6,3CH,3,COOH,反应在,厌氧条件下,进行的，由己糖或戊糖生成醋酸的理论产率都是,100,。,热醋酸梭菌为,产芽孢菌，,，周生鞭毛，耐高温,，最适生长温度,55,60C,，转化率高，,严格厌氧,，还可以利用戊糖。但,这种方法发酵时需,中和剂,，因此只适合于,醋酸盐,。,第三节 谷氨酸发酵机制,氨基酸发酵工业是利用微生物的生长和代谢活动生产各种氨基酸的现代工业。氨基酸发酵是典型的,代谢控制发酵。,由发酵所生成的产物,氨基酸，都是微生物的中间代谢产物，它的积累是建立于,对微生物正常代谢的抑制,。也就是说，氨基酸发酵的关键是取决于其控制机制是否能够被解除，是否能打破微生物的正常代谢调节，人为地控制微生物的代谢。,一,.,谷氨酸生物合成途径,谷氨酸的生物合成途径有,EMP,途径、,HMP,途径、,TCA,循环、乙醛酸循环和,CO,2,固定反应。葡萄糖先生成谷氨酸，依次经鸟氨酸，谷氨酸生物合成精氨酸。,谷氨酸的生物合成途径如图所示,。,三,.,谷氨酸发酵的代谢控制,谷氨酸发酵的代谢控制一般采取下列措施。,1,控制发酵的环境条件,氨基酸发酵受菌种的生理特征和环境条件的影响，对,专性好氧菌来说，环境条件的影响更大,。谷氨酸发酵必须严格控制菌体生长的环境条件，否则就几乎不积累谷氨酸。,谷氨酸生产菌因环境条件改变而引起的,发酵转换,，这也就是说氨基酸发酵是人为地控制环境条件而使发酵发生转换的一个典型例子。,2,控制细胞膜渗透性,在发酵过程中，控制使用那些,影响细胞膜通透性,的物质，有利于代谢产物分泌出来，从而避免了,末端产物的反馈调节,，有利于提高发酵产量。,以葡萄糖为原料，利用,谷氨酸,棒状杆菌发酵生产,谷氨酸时，谷氨酸生产菌为,-,酮戊二酸脱氢酶缺失突变株,，,当,谷氨酸的合成,达到,50 mg/g,（干细胞）时，由于,反馈调节,作用，谷氨酸的合成便终止。如果,改变细胞膜通透性,，使胞内代谢产物,谷氨酸,渗透到胞外,，有利于提高发酵产量。,所以代谢产物的,细胞渗透性是氨甚酸发酵必须考虑的重要因素。,对于谷氨酸发酵来说，生物素是谷氨酸发酵的关键物质。当细胞内的,生物素水平高,时，谷氨酸不能透过细胞膜，因而得不到谷氨酸。,谷氨酸发酵生产中，谷氨酸生产菌属于,生物素缺陷型,菌种，生物素作为脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰,CoA,羧化酶的辅酶，,参与了脂肪酸的合成,，进而影响磷脂的合成。当,磷脂合成减少到正常量的一半左右时，细胞变形，谷氨酸向膜外漏出，积累于发酵液中。,因而可以通过限量控制生物素的含量，也就是通过,控制,生物素亚适量,，提高细胞膜的渗透性,。,在发酵的前期，满足细胞的生长，合成完整的细胞膜；中期生物素耗尽，细胞膜合成不完整，完成长菌型细胞向产酸型细胞的转变，细胞膜的渗透性增加，,使得谷氨酸渗透到细胞外，在细胞内谷氨酸达不到引起反馈调节的程度，从而使谷氨酸能够源源不断被优先合成。,影响谷氨酸产生菌细胞膜通透性的物质可分为两大类：,一类是,生物素、油酸和表面活性剂,，其作用是引起细胞膜的脂肪酸成分或量的改变，尤其是改变油酸含量，从而改变细胞膜通透性；,另一类是,青霉素,，其作用是抑制细胞壁,肽聚糖合成中肽链的交联,，由于细胞膜失去细胞壁的保护，细胞膜受到物理损伤，从而使渗透性增强。,另外，代谢控制还包括控制支路代谢，消除终产物的反馈抑制和反馈阻遏等等。,第五节 抗生素发酵机制,次级代谢产物,-,(secondary metabolite),分解代谢,：将从环境中吸收的各种碳源、氮源等物质,降解,，为细胞的生命活动提供,能源,和,小分子中间体。,如,TCA,、,EMP,和,HMP,等,。,合成代谢,：利用分解代谢的能量和中间体,合成,氨基酸、核酸等,单体物质，及,蛋白质、核酸、多糖等,多聚物。,代谢类型,一,.,初级代谢和次级代谢,初级代谢：,与生物生存有关的,，涉及,能量产生,和,能量消耗,的代谢类型。产物都是有机体生存,必不可少,的物质，如单糖、核苷酸、脂肪酸，以及蛋白质、核酸、多糖、脂类等。,次级代谢：某些微生物为了避免代谢过程中，某种代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类,有利于生存,的代谢类型，通常是在,生长后期,产生。产物种类很多，最著名的是,抗生素,，,其它还有氨基糖、,香豆素、麦角生物碱、吲哚衍生物、核苷、肽、喹啉,等。,二、微生物合成抗生素与初级代谢的关系,1.,从代谢方面分析：,许多抗生素的基本结构是由少数几种初级代谢产物构成的，所以,次级产物是以初级产物为母体衍生出来的,，次级代谢途径,并不是独立,的，而是与初级代谢途径有,密切联系,的。,糖代谢的中间体，既可以来合成初级代谢产物，又可以来合成次级代谢产物，这种中间体叫,分叉中间体,，如,丙二酰,Co,。,G,乙酰,Co,丙二酰,CoA,脂肪酸,（初级）,四环素或其他抗生素（次级）,初级代谢和次级代谢的,分叉中间体,分叉中间体初级终点产物次级终点产物,氨基己二糖 赖氨酸,青霉素,头孢酶素,丙二酰,Co,脂肪酸 四环素族,利福霉素族,乙酰,Co,大环内酯族,多烯族抗生素,莽草酸 对氨基苯丙氨酸氯霉素,绿脓菌素,苯丙氨酸,酪氨酸新生霉素,由初级代谢产物衍生的次级代谢产物的途径有七种：葡萄糖碳架掺入途径、莽草酸途径、与核苷有关的途径、聚酮糖途径、由氨基酸衍生的途径、甲羟戊酸途径、其它复合途径。,2.,从遗传方面分析：,初级产物和次级产物同样,都受到核内,DNA,的调节控制的。,所不同的是次级代谢产物还受到,“,与初级代谢产物合成无关的遗传物质,”,的控制，即受核内遗传物质（染色体遗传物质）和,核外遗传物质（,质粒,）,的控制。,有一部分代谢产物的形成，取决于由质粒信息产生的酶所控制的代谢途径，这类物质称为质粒产物,。由于这类物质的形成直接或间接受质粒遗传物质的控制,因而产生了,质粒遗传,的观点。当然也有只由染色体,DNA,控制的抗生素。,因此，两者在遗传上既有相同的部分，又有不同的部分。,三 抗生素生产菌的主要,代谢调节机制,受,DNA,控制的酶合成的调节机制,，包括酶的诱