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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,*,第三章 高效液相色谱法,High Performance Liquid Chromatography,2,第一节、,概述,一、色谱法的定义,色谱法是一种,分离,方法。,它的特点是:有两相,一是固定相,一是流动相,两相作相向运动。,将色谱法用于分析中,则称为色谱分析。,色谱分析是一种分离、分析法。,3,二、色谱法分离原理,当流动相中所携带的混合物流过固定相时,就会和固定相发生作用,(,力的作用,),。由于混合物中各组分在,性质和结构,上有差异,与固定相发生,作用的大小,也有差异。因此在同一推动力作用下,不同组分在固定相中的滞留时间有长有短,从而按先后不同的次序从固定相中流出,。,4,三、色谱法的分类,按流动相状态的不同,可分为,气相色谱法,(GC),以气体为流动相的色谱法,液相色谱法,(LC),以液体为流动相的色谱法,超临界流体色谱,(SFC),5,气相色谱法,适合分离分析,易汽化(,在,-190,-500,范围内有,0.2-10mmHg,的蒸气压的),稳定、不易分解、不易反应,的样品,特别适合用于,同系物、同分异构体,的分离。,液相色谱法,适合分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。,6,按固定相使用的形式可液相色谱法又可分为:,柱色谱(,Column Chromatography,),将固定相装在色谱柱内,纸色谱(,Paper Chromatography,),用滤纸做固定相或固定相载体的色谱,薄层色谱(,Thin Lay Chromatography,),固定相均匀涂在玻璃板或塑料板上,四、高效液相色谱,(一)高效液相色谱(,HPLC,)含义:,高效能固体细微粒为固定相,高压溶剂为流动相,高灵敏度检测器,8,死时间,(,t,M,):,完全不保留组分流出系统的时间,保留时间,(,t,R,):,调整保留时间,(,t,R,):,死体积,(,V,M,):,保留体积,(,V,R,):,调整保留体积,(,V,R,):,(二)高效液相色谱与其它色谱方法的比较,1.HPLC,与经典,LC,的比较,经典,LC,HPLC,固定相颗粒,100m,不均匀,固定相颗粒,BC,正、反相色谱中极性和保留时间的关系,44,R:,分离度,t,R,:,保留时间,t,0,:死时间,W,:峰底宽度,五,.,色谱分离基本方程,(一)分离度(,R,),反映的是相邻两个峰的分开程度,45,不同,R,值时,峰重叠情况示意图,R1.5,可以得到基线分离,R,太小,两个峰无法彻底分离,R,太大,分离时间过长,工作效率低下,一般要求,R1.5,,也可遵循行业特殊规定,46,其中:,n:,理论塔板,:分离选择性因子,,K:,分配系数,根据该公式优化试验条件,提高分离度,R,。,从数学推导来看,分别增大,n,,,,,k,值,都可以提高分离度。,(二)色谱分离基本方程,1,、选择因子,在定性分析中,通常固定一个色谱峰作为标准(,s,),然后再求其它峰(,i,)对这个峰的相对保留值,此时可用符号,表示,即,=t,r,(i)/t,r,(s),式中,t,r,(i),为后出峰的调整保留时间,所以,总是大于,1,的。,相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标,又称选择因子。,48,分离选择性(,)对分离度(,R,)的影响,如果,t,0,=1min,=1.64/1.58=1.04,=1.15/0.85=1.35,=0.95/0.63=1.50,改变分离选择性,的方法,改用不同的流动相,改变流动相的组成,并非必须大于,1.5,!,改变流动相,pH,值 尽量优化前几种实验条件提高,a,值,,改变柱温 避免改变固定相(买新柱子),以便降低成本,应用特殊的化学效应,改变固定相,2,、,分配系数,K,指在一定温度和压力下,组分在固定相和流动相之间分配达平衡时的浓度之比值,即,K=,溶质在固定相中的浓度,/,溶质在流动相中的浓度,=,C,s,/,C,m,分配系数是由组分和固定相的热力学性质决定的,它是每一个溶质的特征值,它仅与,三,个变量有关:固定相,、流动相,和温度。与两相体积、柱管的特性以及所使用的仪器无关,50,3,、理论塔板数和理论塔板高度的计算方法,理论塔板数,理论塔板高度,HETP=L/n,理论塔板数,n,越大,柱效越高;理论塔高度,HETP,越小,柱效越高,51,柱效(,n,)对分离度(,R,)的影响,以上两张谱图,k,,,值完全相同,仅仅由于柱效高低不同使得它们具有不同的分离度。,直观的看,峰的尖锐程度代表了柱效高低,峰越尖锐,其柱效越高,通常使用理论塔板数(,n,)的大小衡量柱效的高低,52,4,、容量因子(,k,)对分离度(,R,)的影响,容量因子越大,分离度越大。,k 1 3 5 7 9 11 13 ,k/k+1 0.50 0.75 0.83 0.88 0.90 0.92 0.93 1.00,但当容量因子大于,10,,,k/(k+1),的改变不大,而分析时间将大大延长。因此,,k,的最佳范围是,1k,电泳时,阴离子在负极最后流出,2,、毛细管凝胶电泳,CGE,将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。,其具有多孔性,类似分子筛的作用,试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散,所得峰型尖锐,分离效率高。,蛋白质、,DNA,等采用,CGE,能获得良好分离,,DNA,排序的重要手段。,特点:抗对流性好,散热性好,分离度极高。,(,1,)缓冲溶液中加入离子型表面活性剂,其浓度达到临界浓度,形成一疏水内核、外部带负电的胶束。,3,、胶束电动毛细管色谱,(,MECC,,,MEKC,),在电场力的作用下,胶束在柱中移动。,(,2,)电泳流和电渗流的方向相反,且,电渗流,电泳,,负电胶束以较慢的速度向负极移动;,(,5,)色谱与电泳分离模式的结合。,(,3,)中性分子在胶束相和溶液(水相)间分配,疏水性强的组分与胶束结合的较牢,流出时间长;,(,4,)可用来分离中性物质,扩展了高效毛细管电泳的应用范围;,加电渗流改性剂使电渗流反向,用于淌度很大的离子的分离,主要是无机阴离子的分离。负高压,。,加阳离子表面活性剂,如十六烷基三甲基溴化铵,电渗流,X,X,X,X,X,(),高压,(),地,4,、毛细管离子分析,三、高效毛细管电泳仪器,清洗,记录,检测器,高压电源,毛细管,电解液,1,、高压电源:产生,030kV,稳定连续可调电压,2,、,进样系统,进样量:毛细管长度的,1%-2%,;纳升级、非常小;,进样端加压、出口端抽真空、虹吸进样,4,、检测系统,商品仪器:,UV-VIS,;荧光 实验室:质谱,电分析,5,、清洗系统,一般用负压法,,NaOH,洗液,减少吸附,3,、毛细管柱:,毛细管分离柱不涂敷任何固定液,四、应用及前景,特点,:,A,、分离效率高:,10,4,理论塔板数,接近,GC,空心管,无固定液,,H=B/u,;流型不同,B,、,分离速度快:优于,LC,,接近,GC,C,、进样量少:,nL,应用:,药物分析:旋光异构体,生化分析:氨基酸衍生物、蛋白、,DNA,弱点:,检测器绝对灵敏度高,但浓度灵敏度仅为,10,-6,
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