血清蛋白电泳-醋纤电泳、圆盘电泳实用全套.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,血清蛋白电泳(din yn)-醋纤电泳(din yn)、圆盘电泳(din yn),第一页，共29页。,带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。,电泳技术(jsh)即是利用样品中各种带电粒子的带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品分子进行分离、鉴定、纯化和制备。,在生物医学领域，该技术(jsh)多用于分离，纯化、鉴定蛋白质、核酸等大分子物质。,一、电泳技术,第二页，共29页。,电泳(din yn)的分类,(1)按支持物的装置形式不同分为：,1平板式电泳：支持物水平(shupng)放置；,2垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；,3垂直柱式电泳：聚丙烯酰胺盘状电泳,第三页，共29页。,掌握电泳(din yn)法分离血清蛋白质的原理,掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳(din yn)的操作方法及临床意义,二、实验(shyn)目的,第四页，共29页。,本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持(zhch)体的区带电泳。,方法是将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的乙酸纤维素薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在此缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。,三、实验(shyn)原理,第五页，共29页。,醋酸纤维素膜：该膜具有均一的泡沫状的结构，厚度约为120 m，有很强的通透性，对分子移动阻力很小。该薄膜电泳具有微量、快速、简便、分辨力高，对样品无拖尾和吸附(xf)现象等优点,第六页，共29页。,蛋白质名称,等电点,相对分子质量,清蛋白,4.88,69000,1,-球蛋白,5.06,200000,2,-,球蛋白,5.06,300000,-,球蛋白,5.12,90000150000,-,球蛋白,6.857.50,156000300000,人血清(xuqng)蛋白质的等电点及分子量,第七页，共29页。,经醋酸纤维(c sun xin wi)素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、1球蛋白、2球蛋白、球蛋白及球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。,2,1,清蛋白,第八页，共29页。,1.实验材料：未溶血的人血清,2.实验试剂：,巴比妥缓冲液 氨基黑10B0.5染色(rns)液,漂洗液 透明液,3.实验器材：,醋酸纤维薄膜（28cm）,常压电泳仪 镊子,点样器 玻棒,粗滤纸 培养皿,吸量管 直尺及铅笔,四、试剂(shj)及器材,第九页，共29页。,第二十八页，共29页。,电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。,待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时(tngsh)分辨出光滑面和粗糙面。,2垂直板式电泳：聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳；,加蒸馏水至100ml,电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。,三、实验(shyn)原理,待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时(tngsh)分辨出光滑面和粗糙面。,点样后电泳槽一定要密闭。,第二十六页，共29页。,点样器 玻棒,醋酸纤维薄膜（28cm）,点样（关键(gunjin)）,每个槽上都有一根可移动(ydng)的横杆，纱布的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了纱布桥。,血清蛋白电泳(din yn)-醋纤电泳(din yn)、圆盘电泳(din yn),1.准备,醋酸纤维素薄膜的预处理：,将薄膜小心放入盛有缓冲液的培养皿内，使其漂浮在液面；用镊子轻压，使其全部浸入缓冲液内。待膜完全浸透（约半小时）后取出，夹在清洁的滤纸中间，轻轻吸去多余的缓冲液，同时(tngsh)分辨出光滑面和粗糙面。,标记：在粗糙面上用铅笔距薄膜条一端1.5cm处划线即为点样线并作好标记。,五、试验(shyn)方法,第十页，共29页。,电泳槽的准备,电泳槽有两个互相隔离的槽，各自装有缓冲液，接不同的电极，红色为正极，黑色为负极。每个槽上都有一根可移动(ydng)的横杆，纱布的一头搭在横杆上，另一头浸入缓冲液中，形成了纱布桥。,第十一页，共29页。,2.点样（关键(gunjin)）,取出浸透的薄膜，平放在滤纸上(无光泽面向上)，用滤纸轻轻吸去多余的缓冲液，薄膜的粗糙面向上平放在点样模版上，底边对齐，点样区距负极1.5cm。点样时，用磨光的玻片蘸取血清后，均匀的涂抹在点样区，使血清完全渗透至薄膜内，形成一定宽度、粗细均匀的直线。（见图）,注意：点样时动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。,另外(ln wi)操作过程要防止指纹污染。,第十二页，共29页。,3.电泳,将点样端的薄膜平贴在阴极电泳槽支架的滤纸桥上（点样面朝下），另一端平贴在阳极端支架上。要求薄膜紧贴滤纸桥并绷直，中间不能下垂，使膜平衡10min。,连接(linji)好电泳仪。在室温下电泳，打开电源开关，电压160v，60min。,点样端,1.滤纸桥 2.电泳槽 3.醋酸纤维素薄膜 4.电泳槽膜支架 5.电极室中央(zhngyng)隔板,第十三页，共29页。,4.染色,电泳完毕立即取出薄膜，直接浸入染色液中，染色5min。,5.漂洗,用漂洗液漂洗，不停摆动薄膜条，每10min左右换一次液，连续更换数次，直至背景颜色脱去。将膜夹在干净滤纸中，吸去多余溶液。,操作(cozu)中，注意控制染色和漂洗的时间，防止背景过深或某些区带太浅。,第十四页，共29页。,6.记录和分析实验结果(ji gu)漂洗完毕后将薄膜取出,放在滤纸上。将薄膜上的5条色带根据其颜色深浅、形状、大小及相对位置进行描述、记录在实验本上，并判断分析其结果(ji gu)。,第十五页，共29页。,血浆蛋白是血浆最主要(zhyo)的固体成分，含量6080g/L,绝大部分由肝脏合成，仅球蛋白由浆细胞合成,正常值：白蛋白5772，1球蛋白25,2球蛋白49，球蛋白6.512,球蛋白1220,血浆蛋白的主要(zhyo)功能:维持血浆胶体渗透压 调节血浆pH值,维持酸碱平衡 运输营养物质,代谢物,激素,药物及金属离子等 免疫作用,七、临床意义,第十六页，共29页。,注意事项,1、醋酸纤维素薄膜一定要充分(chngfn)浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。,2、点样时，动作要轻、稳，用力不能太大，以免损坏膜片或印出凹陷影响电泳区带分离效果。,3、点样应点在薄膜的毛面上，点样量要适量，不宜过多或过少。,4、电泳时应将薄膜的点样端置于电泳槽的负极端，且点样面向下。,5、通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再取薄膜，以免触电。,6、应控制染色时间。时间长，薄膜底色不易脱去；时间太短，着色不易区分，或造成条带染色不均匀，必要时可进行复染。,第十七页，共29页。,血清蛋白质聚丙酰胺凝胶圆盘(yun pn)电泳,第十八页，共29页。,1.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理,2.掌握(zhngw)聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳的操作技术,一、实验(shyn)目的,第十九页，共29页。,二、实验(shyn)原理,聚丙烯酰胺凝胶：由丙烯酰胺（简称Acr）单体,少量交联剂甲叉双丙烯酰胺,通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）,作为加速(ji s)剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。,第二十页，共29页。,第二十一页，共29页。,三、实验(shyn)器材与试剂,1.实验材料(cilio)：正常人血清,2.实验器材：圆盘电泳槽、电泳仪、玻璃管（10cm0.6cm）、洗耳球、培养皿、微量加样器、注射器、小烧杯,第二十二页，共29页。,试剂号,配方,PH,1,单体交联剂 丙烯酰胺（Acr）30g,甲叉丙烯酰胺（Bis）0.8g,加蒸馏水到100ml,2,过硫酸铵1g+10ml蒸馏水,3,四甲基乙二胺（,TEMED,）,4,电泳缓冲液 硼砂 30.512g,硼酸 4.948g,蒸馏水定容至 1000ml,工作液：90ml贮储液+1440ml水,9.0,5,固定液 三氯乙酸 12.5g,蒸馏水定容至 1000ml,6,染色液 CBB G-250 0.1g 溶于95%乙醇后，加,蒸馏水 到 100ml,3.实验(shyn)试剂,第二十三页，共29页。,7,分离胶缓冲液 Tris 6.06g,EDTA 1.17g,定容至100ml,8.,8,8,上样缓冲液 电泳缓冲液 25ml,蔗糖 10g,0.05溴酚蓝 5ml,加蒸馏水至100ml,9,洗脱液、保存液 冰乙酸 38ml,甲醇 125ml,蒸馏水 338ml,第二十四页，共29页。,四、实验(shyn)方法,1.凝胶柱的准备,（1）取一只10cm0.6cm洁净干燥的玻璃管，在7cm和8cm两处做一个记号，一端用封口膜严实(yn shi)，垂直放好。,（2）.按下表配制分离胶溶液,试剂,分离胶（ml）,分离胶缓冲液,单体交联剂,双蒸水,10过硫酸铵,TEMED,1,2.1,6.8,0.1,0.01,把分离胶溶液混匀后，用自动取液器吸取(xq)上述配好的分离凝胶贮液沿着小玻管内壁小心准确加入7 cm高。,第二十五页，共29页。,（3）凝胶溶液加毕后，随即吸取蒸馏水，加至管中的凝胶表面，使其表面覆盖一水层（水封，1.0cm 高）。在灌胶和封水的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。,（4）将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约30-60分钟后，待界面出现(chxin)明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，先用习惯吸去上面的水层，在用滤纸将残留的水分吸干。,2.样品液制备,取正常人血清0.1ml，与1.9ml的上样缓冲液混合,3.装柱,将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡(上电极槽以电极和凝胶管完全浸入为宜，下电极槽以凝胶管浸入3/5为宜)。用微量注射器吸去混合后的样品液30l加到分离胶面上（加样枪不可插入过深，以免刺破凝胶，同时要缓慢、均匀，以免搅动缓冲液引起样品扩散(kusn)），最后加入电泳缓冲液。,第二十六页，共29页。,4.电泳,接通(ji tn)电源，上负下正，调节电流3mA/管，电压260V-280V，待示踪染料离管下口0.5cm时切断电源。,第二十七页，共29页。,5.剥胶,注入蒸馏水做润滑剂，针头螺旋式前进，缓缓剥离，最后用洗耳球在管的一端(ydun)轻轻挤压，另一端(ydun)对着一干净大小适宜的培养皿内，此时可以将凝胶柱压出玻管。,第二十八页，共29页。,谢谢(xi xie)观看,第二十九页，共29页。,