细菌内双组分信号传导.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细菌内双组分信号转导,一、概念,二、双组分信号转导系统的组成,三、双组份信号转导,对生物学活性的调控作用,四、双组分系统转导通路的研究方法,五、双组分系统,研究过程,一、概念,1.,信号转导,2.,微生物信号转导,3.,细菌双组分信号转导,信号转导,细胞或者识别与之相接触的细胞，或者识别周围环境中存在的各种化学和物理信号,并将其转变为细胞内各种分子活性的变化，从而改变细胞的某些代谢过程，影响细胞的生长速度，甚至诱导,细胞凋亡,，这种针对外源信息所发生的细胞应答反应全过程称为信号转导,(signal transduction),。,微生物信号转导,微生物是地球上最多变、适应性最强的有机体，尤其是细菌，能够在动植物无法存活的环境生长。,微生物拥有复杂而精密的信号系统来应对体内外环境变化，从而适应环境并得以生存。,细菌双组分转导,1.,双组分系统是广泛存在于原核和真核细胞中的信号转导系统，主要由组氨酸蛋白激酶（,HPK,）和响应调节蛋白（,RR,）两个组分组成。,2.,双组分系统信号通路一般包括信号的输入,、,HPK,自身磷酸化、信号输出等环节。,3.,从细菌的角度，当它入侵宿主体内时，环境中各种营养物质的含量、温度、渗透压和,PH,值等都发生了改变，同时一些毒性物质也出现在其生存的环境中，因此，细菌为了生存，其必然拥有一套特有的对外部环境持续监控的信号系统，以检测环境中各种生理因素的改变，并据此迅速调节自身的结构和生理行为，达到适应新环境和生存繁殖的目的。,二、双组分信号传导系统的组成,双组分信号通路,HPK感受到外界环境信号后,使RR磷酸化,将外界信号传递到胞内.整个双组分信号通路由,信号输入,(input)、,HPK自身磷酸化,、R,R磷酸化,及,输出,（output)等环节构成,双组分信号转导系统的组成,经典的双组分信号传导系统由,组氨酸激酶,histidine kinase，H,P,K,又称为传感器激酶 和,反应调控蛋白,(response regulator，RR)组成。,双组分系统只负责信号的输入、转导、输出。信号的识别和感受是由其他分子,如细胞表面受体或运输蛋白来完成,由它们再将信号传递到HPK。,双组分信号传导系统的组成,组氨酸激酶,H,P,K,紧贴最外层跨膜部分，位于胞质内。是细菌感应各种环境变化必需的，通常是由两个单体组成的,同源二聚体膜蛋白,，每个单体含有一个,可变 的传感器结构域,和一个,保守的传递器结构域,。其传感器结构域负责检测和编码输入信息。,双组分信号传导系统的组成,组氨酸激酶的传递器结构域由N端,DHp(二聚化组氨酸磷酸转移)结构域,和C端,CA(催化结合ATP)结构域,组成。DHp结构域能形成一个稳定的二聚体结构，其上含有一个能发生自身,磷酸化组氨酸位点,；CA催化结构域由保守的,N、G1、F和 G2,盒组成，含有一个与ATP结合的基序。DHp和 CA结构域连接在一起，使ATP的磷酸基团转移到DHp上的组氨酸位点上，所有双组分系统的传递器结构域都是保守的。,双组分信号传导系统的组成,反应调控蛋白,RR,位于胞质内。是双组分信号转导系统 中的第二个组分，含有一个或多个,保守的N端接受器结构域,又称为输入结构域和,可变的 C端效应器结构域,又称为输出结构域。反应调控蛋白控制输出信息。,双组分信号传导系统的组成,反应调节蛋白在其,N,端为,接收器，,大约,具有120个保守性的,氨基酸顺序和,磷酸化位点,。,C,端功能区具有DNA结合或其它调节功能,对其目标基因进行转录调控。接收器元件和输出功能区常由易弯曲的衔接物连接,。,双组分信号传导系统的组成,当外界或内部环境发生变化时，组氨酸激酶 的传感器结构域能够感应环境的刺激并迅速,二聚化,，导致催化 ATP依赖的特定的组氨酸残基,自我磷酸化,，然后反应调控蛋白催化组氨酸的,磷酸基团转移,到它自身的天门冬氨酸残基上，反应调控蛋白的磷酸化,激活效应器结构域,，从而与下游基 因的启动子或蛋白作用，产生调控应答反应。,双组分信号传导系统的组成,随着双组分系统的广泛研究,尤其是在真菌和高等植物中的研究,发现双组分系统远非只有两个组分,并且无论是信号的输入、还是转导或输出过程,都比原核的双组分系统复杂得多。因而,双组分系统呈现出多样化的特点,。,目前研究结果表明许多双组分系统含有额外的组成，即,调节伴侣蛋白,作用是,辅助磷酸酶的催化,。,三、双组份信号转导,对,生物学活性的调控作用,1,在渗透信号传递过程中的作用,2,在细菌趋化过程中作用,在渗透信号传递过程中的作用,Lorem ipsum dolor sit amet,1,双组分系统在渗透信号传递过程中的作用,在细菌趋化过程的作用,Lorem ipsum dolor sit amet,2,以大肠杆菌为例，一个细胞有410根鞭毛，鞭毛快速旋转使得细胞具有运动的能力。鞭毛的运动方式分为2种：,（1）顺时针旋转(clockwise，CW)：当鞭毛顺时针旋转时，细胞鞭毛分开，原地做翻滚运动，来调整运动方向。这种方式成为翻滚。（图1-A),（,2,）逆时针旋转(counter-clockwise，CCW)：当鞭毛逆时针旋转时，鞭毛拧成一束，产生向前的推动力。这种方式称为泳动。（图,1-B,）,在复杂的环境中，细菌不断地调整鞭毛的运动方式来趋利避害。,趋化受体感知环境信号并引发刺激反应，刺激信号通过CheA（组氨酸激酶）和CheY（反应调节器）传递给鞭毛马达。CheA和CheY是双组分调控系统家族的代表性成员，执行细菌中大多数的信号转导,。,组氨酸激酶CheA是细菌趋化性的重要元件，拥有CheA的微生物都具有趋化特性。CheA是唯一的组氨酸激酶能够被分为5个明显的作用区域 N-末端磷酸转移酶结构域(HPT)，YB 识别反应调节器区域，二聚体结构域（不同于其他组氨酸激酶），催化激酶区域(CA)，CheW结合区域(R)。和所有组氨酸激酶一样，CheA以二聚体的形式发挥作用，一个亚基的激酶区域使另一个亚基保守组氨酸磷酸化,趋化反应信号转导链,RR,蛋白是CheY。CheY 直接和鞭毛马达的转换蛋白FliM相互作用，引发旋转方式的改变。CheY一结合到CheA的YB区域，磷酰基基团从保守的组氨酸传递给CheY保守的天冬氨酸。CheY的磷酸化导致构象的改变，从而导致对CheA 的吸引力下降，对马达蛋白FliM的吸引力增加。磷酸化的CheY从CheA上释放，与鞭毛马达蛋白结合，最终，趋化受体感知的环境信号被传递给了马达，使得微生物发生位移。,组氨酸激酶CheA与甲基趋化受体MCP的细胞质信号区域由连接因子CheW连接，形成一个MCP-CheW-CheA三元复合体CheA蛋白是双组份调控系统中的传感激酶，在ATP存在的情况下可发生自我磷酸化，将磷酸基团转移给CheY，使CheY发生磷酸化,许多鞭毛马达旋转方向由细胞内CheY和CheY-P的比率来控制，鞭毛马达的逆时针和顺时针构象是以平衡状态存在的。CheY-P与FliM和FliN（转动复合物的成分）结合，使鞭毛倾向于进行顺时针旋转。FliM和FliN上具有34个CheY-P结合位点，结合位点被占据的越多，鞭毛顺时针旋转相应地上升。最终调解运动方向,四、双组分系统,转导通路的研究方法,1.,信号蛋白分子定位研究,免疫荧光,技术（,IF),、,流式细胞免疫荧光技术,FCM,2.,信号蛋白分子表达水平及磷酸化检测,RT-PCR/Real-time PCR,（,mRNA,水平）,Western blot,检测通路关键信号分子的表达（蛋白水平）,磷酸化状态,，,蛋白质分子间的相互结合的技术,PhosphoELISA,试剂盒（双抗体夹心）,测蛋白质表达量,或,磷酸化,状态,3,检测通路相互作用蛋白,免疫共沉淀技术（,Co-lP,）,荧光共振能量转移（,FRET,）,4,关键信号分子基因沉默,抑制剂,/siRNA/,基因敲除动物,5,蛋白质与,DNA,相互作用,五、,双组分系统,研究过程,1986,年，,Ninfa,和,Magasnik,在研究大肠杆菌氮调节蛋白系统时，首次发现了双组分系统，用,DNA,序列鉴定了其基因。,2005,年，,Ulrich,等对,145,种细菌基因组进行了测序，在此过程中他们发现了至少,4000,对双组分信号传导系统。,革兰氏阳性,菌,VicRK(YycFG),系统,1.VicRK(YycFG),最初发现于枯草芽孢杆菌中,，,称为,YycFG,。随后通过,序列同源性,查寻，发现该系统存在于少数低,G+C,含量的革兰氏阳性菌中，包括芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌等致病菌（,1999-2002,），高度保守。,2.VicRK(YycFG),大体上可以分成早期发现的以枯草芽孢杆菌为代表的,YycFG,一型和后来发现的以链球菌为代表的,VicRK,二型和链霉菌为代表的,MtrAB,三型。,3,.VicRK(YycFG),具有调控细胞壁合成与代谢、胞膜完整细胞分裂、脂类代谢、多糖合成与被膜形成以及细菌毒力等多种功能，参与细胞的生长、分裂与感染。该系统异常可导致细菌生活力严重下降，甚至死亡，因而成为防治该类病原菌的重要靶标（,1998-2013,）。,由于,VicRK(YycFG),中两组分功能与重要性不同，针对,VicRK(YycFG),的研究较少，更多集中在对,VicRK(YycFG),抑制物,的寻找。,Watanabe,等从微生物的丙酮抽提物中筛查出,7,种,VicK(YycG),有效抑制剂，其中一种成分对枯草芽孢杆菌、金黄葡萄球菌作用明显（,2003,）,;,Furuta,等采用针对组蛋白激酶同源二聚化的高通量遗传筛选系统，获得了一种能够特异性抑制金黄色葡萄球菌,VicK(YycG),二聚化的化学成分（,2005,）；,我国尹一兵等采用体外活性筛选的方法，也获得了一个抑制,VicK(YycG),蛋白激酶功能域较高活性的小分子咪唑类衍生物（,2009,）。,意义,1.,细菌双组分系统是细菌的一种普遍而又很重要的信号传递系统，也是一个基因表达的调节系统。,2.,它的理论意义就在于阐明了细菌对环境变化做出反应的基本过程，为深化细菌行为、生态、生理生化研究奠定了基础。,3.,双组分系统在微生物和一些植物中广泛存在，而人类细胞主要采用丝氨酸 苏氨酸和酪氨酸激酶系统调节蛋白活性，哺乳动物中不含组氨酸激酶，因此如果找到双组分蛋白的,抑制物,，用以对抗微生物感染有重大意义。双组分系统有多个“靶 点”，如感应外界刺激的位点、激酶自主磷酸化位点和反应调控蛋白磷酸化位点等，探究双组分信号转导系统的,机制,，找到双组分蛋白反应的靶点，为更好地设计双组分系统的抑制物提供了条件。,谢 谢,！,